一种游离吸附浓缩重组白介素-2复性液的方法技术

本发明专利技术涉及一种游离吸附浓缩重组白介素‑2复性液的方法，属于生物医药技术领域。本发明专利技术去游离吸附浓缩重组白介素‑2复性液的方法包括如下步骤：从重组白介素‑2发酵液中提取包涵体，将包涵体裂解，获得包涵体裂解液；将包涵体裂解液进行复性处理，得到复性液；在复性液中加入疏水高效液相色谱填料进行搅拌游离吸附，待填料沉降后去掉上层液，收集吸附有重组白介素‑2的色谱填料；用洗脱液对吸附有重组白介素‑2的色谱填料进行洗脱，并收集流岀液，所述流出液即为重组白介素‑2复性浓缩液；本发明专利技术游离吸附浓缩重组白介素‑2复性液的方法方便易行，回收率和产品活性均较高。

【技术实现步骤摘要】
一种游离吸附浓缩重组白介素-2复性液的方法
本专利技术属于生物医药
，涉及一种游离吸附浓缩重组白介素-2复性液的方法。
技术介绍
1976年，Morgrn等首次发现在丝裂原刺激的淋巴细胞培养上清或称条件培养基(Conditionalmedium，CM)中存在一种细胞因子，能选择性地维持T淋巴细胞在体外长期生长，人们将该因子称为T细胞生长因子(Tcellgrowthfactor，TCGF)。1979年瑞士召开的第二届国际淋巴因子会议上将联系白细胞间相互作用的因子统称为白细胞介素(Interleukin，IL)，并将由激活的T细胞产生的、在淋巴细胞间起相互作用的因子，即TCGF称为白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)。IL-2主要由活化的CD4+T细胞和CD8+T细胞(特别是CD4+T细胞)产生，为一种糖蛋白，具有广泛生物活性，能使T细胞在试管内长期存活。随着研究的不断深入，尤其是1983年基因工程(重组)IL-2的问世，使得IL-2的研究取得了更大的进展。人们发现IL-2除了作用于T细胞外，还可作用于多种免疫效应细胞，包括B细胞，巨噬细胞，NK细胞。IL-2可刺激能产生抗体的B细胞增殖并能诱导产生新型的杀伤细胞即淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)，故IL-2成为调控免疫应答的重要因子，具有抗病毒，抗肿瘤及改善和提高机体免疫功能的作用。可提高人体对病毒，细菌，原虫等感染的免疫应答，清除体内肿瘤细胞和病毒感染细胞等。还可以增进抗体和白介素-2的分泌，可刺激产生IFN-γ和TNF-α，β；促进Th的增殖和激活；活化中性粒细胞；刺激NK和肿瘤侵润淋巴细胞(TIL)增殖。目前，IL-2已被应用于治疗肿瘤，免疫缺陷和感染性疾病，并取得了显著的效果。目前市售的lL-2主要以重组人白介素-2为主，以基因工程菌为基础，利用生物发酵法配合大规模的分离纯化技术，最终得到高纯度的重组人白介素-2蛋白质。由于重组蛋白质主要是经过发酵表达所得，发酵液中的成分往往很复杂，有活细胞、死细胞、细胞外产物、细胞内释放物、残余的底物等物质，因此要从如此复杂的环境中得到目的蛋白质，同时又要保持蛋白质的生物学活性，其分离纯化工作相对比较复杂。现有的分离纯化需要将包涵体溶解、复性，然后进行多步膜分离、层析，往往具有步骤繁杂、回收率相对较低等缺点。基因工程菌所表达的重组白介素-2通常以包涵体的形式存在，需要将其变性裂解、纯化再复性，在复性过程中二硫键易发生错配，导致白介素-2活性下降。变性裂解过程中往往需要使用变性剂，在后续工艺中如不去除，在产品进一步进行浓缩时，必然会影响产品活性。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术存在的上述问题，提出了一种游离吸附浓缩重组白介素-2复性液的方法，方便易行，回收率和产品活性均较高。本专利技术的目的可通过下列技术方案来实现：一种游离吸附浓缩重组白介素-2复性剂的方法，所述游离吸附浓缩重组白介素-2复性剂的方法包括如下步骤：S1、从重组白介素-2发酵液中提取包涵体，将包涵体裂解，获得包涵体裂解液；S2、将包涵体裂解液进行复性处理，得到复性液；S3、在复性液中加入疏水高效液相色谱填料进行搅拌游离吸附，待填料沉降后去掉上层液，收集吸附有重组白介素-2的色谱填料；S4、用洗脱液对吸附有重组白介素-2的色谱填料进行洗脱，并收集流岀液，所述流出液即为重组白介素-2复性浓缩液。作为优选，步骤S1所述提取包涵体的过程为对重组白介素-2发酵液进行超声破菌处理，然后离心、用40～60mmol/L、PH8.5～9.0的PBS缓冲液进行洗涤。作为优选，步骤S1所述包涵体裂解在裂解剂中进行，所述裂解剂包括以下组分：0.8～1.2wt％十二烷基硫酸钠(SDS)、8～13mmol/L二硫苏糖醇(DTT)、40～60mmol/LPB缓冲液，所述PB缓冲液的PH为7.0～8.0。作为优选，所述包涵体裂解的时间为5～7h。采用大肠杆菌基因工程菌生产IL-2时，由于IL-2存在于大肠杆菌工程菌的细胞内层膜，且其疏水性很强，IL-2基因在工程菌大肠杆菌中表达时，因大肠杆菌为原核表达系统，没有翻译后加工和修饰，IL-2在细胞内积累而形成不溶性的蛋白质聚合物，即包涵体，因此IL-2通常以包含体的形式存在于大肠杆菌工程菌细胞内。包涵体的外形为球形，为0.5～1μm的折光小体，包涵体中大部分(占50％以上)是克隆表达的产物，这些产物的一级结构是正确的，但没有经过正确折叠形成天然的高级结构，因此没有生物学活性。包涵体经过溶解复性才能得到具有生物学活性的蛋白。包涵体的相对硬度比较大，一般条件下不溶于水，在有如盐酸胍、尿素等较强的变性剂存在的条件下能够发生溶解，此时的蛋白质自身的高级结构被打开，以变性状态存在，这给IL-2的分离纯化带来了较大的困难。因此在进行分离纯化时，首先要破碎菌体，提取包涵体，然后进行复性和分离纯化。本专利技术的裂解剂中SDS能够有效打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，破坏蛋白质分子的二级结构和三级结构，使多肽伸展，DTT作为还原剂可以打开包涵体蛋白质中所有二硫键，从而使包涵体充分裂解，形成多肽链。作为优选，步骤S2所述复性处理的步骤为：先采用0.8～1.2wt％十二烷基硫酸钠(SDS)将包涵体裂解液稀释至蛋白浓度不超过4mg/ml，然后加入复性剂搅拌稀释至包涵体裂解液中的蛋白浓度为0.1～0.2mg/ml，且SDS浓度至0.05～0.06wt％。作为优选，所述复性剂为40～60mmol/L的PB缓冲液，PH为7.0～8.0。SDS既是包涵体的裂解剂(即蛋白质的变性剂)也是IL-2的助溶剂，IL-2分子与SDS充分结合形成带负电荷的IL-2-SDS复合物，复合物所带的负电荷大大超过了IL-2分子原有的电荷量，消除了不同IL-2分子之间原有的电荷差异，从而增加了IL-2的溶解性。本专利技术通过在复性处理过程中，先添加SDS对包涵体裂解液进行稀释到特定浓度(不超过4mg/ml)，从而在进一步添加复性剂时，将包涵体裂解液中的蛋白浓度和SDS浓度同时控制在特定范围内，以保证复性过程中IL-2不会聚合；如复性处理后包涵体裂解液中的蛋白浓度高于0.2mg/ml范围内，或SDS浓度低于0.05wt％时，均会导致IL-2复性过程中易聚合。作为优选，步骤S3所述疏水高效液相色谱填料为硅胶基质，其表面键合有疏水基团，所述疏水基团为苯基基团。本专利技术采用键合有苯基基团的硅胶基质色谱填料对重组白介素-2进行吸附，苯基基团疏水作用强，对重组白介素-2具有优异的吸附性能。作为优选，所述疏水高效液相色谱填料的颗粒度为16～25μm本专利技术通过控制填料的颗粒度，使得填料在悬浮吸附复性液中lL-2后，能够快速有效自然沉降，无需等待时间过久，即可进行下一步操作，倾倒出上清液，进行洗脱。作为优选，步骤S4所述洗脱包括采用洗脱液Ⅰ进行第一次洗脱，然后采用洗脱液Ⅱ进行第二次洗脱，收集第二次洗脱的流出液，所述洗脱液Ⅰ包括以下组分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种游离吸附浓缩重组白介素-2复性剂的方法，其特征在于，所述游离吸附浓缩重组白介素-2复性剂的方法包括如下步骤：/nS1、从重组白介素-2发酵液中提取包涵体，将包涵体裂解，获得包涵体裂解液；/nS2、将包涵体裂解液进行复性处理，得到复性液；/nS3、在复性液中加入疏水高效液相色谱填料进行搅拌游离吸附，待填料沉降后去掉上层液，收集吸附有重组白介素-2的色谱填料；/nS4、用洗脱液对吸附有重组白介素-2的色谱填料进行洗脱，并收集流岀液，即为重组白介素-2浓缩液。/n

【技术特征摘要】
1.一种游离吸附浓缩重组白介素-2复性剂的方法，其特征在于，所述游离吸附浓缩重组白介素-2复性剂的方法包括如下步骤：
S1、从重组白介素-2发酵液中提取包涵体，将包涵体裂解，获得包涵体裂解液；
S2、将包涵体裂解液进行复性处理，得到复性液；
S3、在复性液中加入疏水高效液相色谱填料进行搅拌游离吸附，待填料沉降后去掉上层液，收集吸附有重组白介素-2的色谱填料；
S4、用洗脱液对吸附有重组白介素-2的色谱填料进行洗脱，并收集流岀液，即为重组白介素-2浓缩液。


2.根据权利要求1所述游离吸附浓缩重组白介素-2复性剂的方法，其特征在于，步骤S1所述提取包涵体的过程为对重组白介素-2发酵液进行超声破菌处理，然后离心、用40～60mmol/L、PH8.5～9.0的PBS缓冲液进行洗涤。


3.根据权利要求1所述游离吸附浓缩重组白介素-2复性剂的方法，其特征在于，步骤S1所述包涵体裂解在裂解剂中进行，所述裂解剂包括以下组分：0.8～1.2wt％十二烷基硫酸钠(SDS)、8～13mmol/L二硫苏糖醇(DTT)、40～60mmol/LPB缓冲液，所述PB缓冲液的PH为7.0～8.0。


4.根据权利要求1所述游离吸附浓缩重组白介素-2复性剂的方法，其特征在于，步骤S2所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱文瑾，李浛民，陈平，
申请(专利权)人：宁波博睿瀚达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33