一种检测聚合酶链式反应（ＰＣＲ）产物的方法，包括： （ａ）在含ＰＣＲ溶液容器中装配至少一对电极； （ｂ）进行ＰＣＲ； （ｃ）在电极间产生电场；以及 （ｄ）检测ＰＣＲ溶液中的电介质特性变化。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
专利
本专利技术涉及一种利用电信号检测聚合酶链式反应(PCR)产物的方法。相关技术描述代表性的生物传感器包括酶传感器以及利用免疫体系免疫应答的免疫传感器。但是，由于人类基因组计划的完成得到了大量DNA信息，因此，人类遗传疾病早发现和治疗的可能性和期望随之增加，DNA芯片快速出现成为另一种类型的生物传感器。目前，开发生物传感器中活跃的研究领域是探询获得低制造成本、快速、准确、易操作特性、以及小型化(便携性)的可能性。从这个角度上讲，用DNA信息进行人类疾病早期检测的DNA传感器也必须符合上述要求以增加国际市场竞争力。一种基本的遗传检测为PCR DNA检测，自从其在1980年代后期专利技术以来已经在临床、生物以及遗传实验室得到广泛应用。传统的PCR通过在PCR反应的终点对进行凝胶电泳显示出扩增的DNA的定性结果，但有很多问题例如DNA定量检测的不准确。因此，实时PCR开发用来通过检测荧光强度定量检测扩增的DNA，荧光强度与扩增的DNA浓度成比例，利用光学检测系统进行检测。DNA的定量检测对疾病治疗和DNA表达的研究而言是必须的。例如，为了保证感染乙型肝炎病毒(HBV)的病人得到成功的医学治疗，必须定期利用实时PCR检测血浆中HBV的浓度以测试HBV的药物抗性。常规的实时PCR需要多种光学装置例如激光源、微型反射镜、显微镜和滤镜，以及昂贵的荧光染料。并且，因为常规的实时PCR芯片基于荧光检测的原理，从微型化(芯片上)和经济效率的角度讲，存在许多缺点。为了解决该问题，有人尝试用毛细管电泳(CE)利用电学方法检测DNA的努力[Christa L.Colyer等，Journal of Chromatography A，Volume 781，Issues 1-2，26 September 1997，pp.271-276；F.Laugere等，Sensors andActuators BChemical，Volume 83，Issues 1-3，15March 2002，pp.104-108；Pumera et al.，Anal.Chem.，2002，74(9)，pp.1968-1971)。该方法可以进行定性分析，但进行定量分析时存在很多问题。并且，在PCR完成后，用微型通道将PCR产物转移到CE检测系统是一个费力的过程，而且需要高电压。因此，不满足经济效率和微型化的要求。Miles等提交了一项美国专利申请，其以申请号2002/007254A1进行了公开，该专利技术申请的思想是在PCR过程中，随着DNA的浓度增加，阻抗下降而传导性增加。但是，Miles的关于阻抗在PCR过程中随着DNA的浓度增加而下降的思想与本专利技术者证实的事实刚好相反。因此，本专利申请来自对PCR反应的机理的不同理解。在PCR过程中，dNTPs解离成dNMPs以及许多二磷酸盐。同时，利用与模板DNA互补的引物dNMPs聚合成DNA。在这种情况下，Miles等的公开只考虑了副产物二磷酸盐的电迁移率。但是，考虑到随着DNA浓度的增加，由在DNA合成过程中所有带电的dNMPs、引物和模板导致整体电迁移率下降，由于电迁移率的下降从而PCR反应的阻抗升高。此外，Miles的专利技术涉及进行终点检测的PCR芯片而不是实时PCR芯片。并且，也存在必须用离子化的标记探针以检测扩增的PCR产物的问题。专利技术概述本专利技术提供了一种通过测量PCR溶液中的电信号检测聚合酶链式反应(PCR)产物的方法。本专利技术提供了一种检测PCR产物的方法，包括(a)在含PCR溶液的容器中，装配至少一对电极；(b)进行PCR；(c)在电极间产生电场；并且(d)检测PCR溶液中的电介质特性变化。附图简介本专利技术的上述及其他特征以及优点，通过对代表性的技术方案并参考下面附图进行详细的描述而变得更清楚；附图说明图1为装配有电极的PCR管的视图；图2为一种含装配电极PCR室的PCR芯片实例的视图；图3至5分别为图2的PCR芯片的平视图、纵向剖面图以及横向剖面图；图6和7为图2的PCR芯片的聚合反应室(polymerization chamber)和电极的加工方法视图；图8为在对照PCR循环中阻抗实部(impedance real part)为频率的函数的变化曲线；图9为在对照PCR循环中阻抗幅值(impedance magnitude)为频率的函数的变化曲线；图10为在实际PCR循环中阻抗实部为频率的函数的变化曲线；图11为在实际PCR循环中阻抗幅值为频率的函数的变化曲线；图12为在对照PCR循环中阻抗幅值的变化曲线；图13为在实际PCR循环中阻抗幅值的变化曲线；以及图14为经过误差校正的实际PCR循环中阻抗幅值变化曲线。专利技术详述依据本专利技术，在步骤(a)中，含PCR反应溶液的容器包括，但不限于，常规的大体积(bulk)PCR管以及聚合微型室(polymerization microchamber)。电极以彼此相对的方式安装在PCR反应容器中。在大体积PCR管的情况下，电极安装在从管底算起的预定高度位置，彼此相对。同时，在聚合微型室的情况下，电极安装在微型室的上侧和下侧或左侧和右侧，这样成彼此相对的方式。电极常规方法加工例如光刻方法。多种金属电极例如铜(Cu)电极，铬(Cr)-金(Au)电极，以及砷(As)-搀杂硅电极可用做上述的电极。在步骤(b)的PCR反应中，除了PCR反应物和溶液，不需要产生电信号的特异标记的探针或引物。因此，与Miles的专利不同，不需要使用离子化标记的引物。依据本专利技术，PCR产物可不用产生电信号的特异标记的探针或引物进行检测，但不限于这些。在步骤(c)中，用常规交流(AC)或直流(DC)发生器产生电场，其连接到电极对上。优选地，AC频率范围为1Hz～100MHz并且平均AC电压(Vrms)范围为1mV～10V。在步骤(d)中，电介质特性(dielectric property)包括，但不限于，阻抗，介质损耗，介电常数，以及导纳(admittance)，这些都源自电场。这些电(场)相关系数可以用连接到电极的电介质特性测量装置测量出来，例如，可以使用可操作性地连接到电极的阻抗传感器。在下文中，本专利技术通过实施例将进行更明确的描述。但是，下列实施例只是用于例举说明，因此，本专利技术不限于或不被其所限制。实施例实施例1装配电极PCR管的制造在常规PCR管上打孔，将电极通过孔插入到PCR溶液的中央部位。然后，将电极连接到PCR设备然后进行PCR的同时，每一轮PCR循环后就立即检测电信号。在实施例1中，测量扩增的DNA的阻抗。详细地，在0.2ml PCR管的两侧打孔，孔径0.3mm，孔距离管底5mm。然后，将直径为0.32mm的导线插入到孔中，作为电极。电极是Teflon绝缘的、镀银铜导线。电极固定在管壁上，使用热环氧树脂使电极间保持1.5mm的距离。为了降低电极的表面积，存在PCR溶液的管下部分的直径保持到约1.5mm，并且将小号电极安装在管壁表面(图1)。因此，可以减少可能发生在电极表面的对酶或PCR组分的吸附，从而增加了检测灵敏度和产物产率。实施例2在室中具有上位和下位电极的三层结构的PCR芯片的制造依据图6和7显示的方法进行制备在室中具有上位和下位电极的PCR芯片。首先，用热氧化在搀本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
【专利技术属性】
技术研发人员：李哉勋，李在昌，尹大成，林根培，
申请(专利权)人：三星电子株式会社，
类型：发明
国别省市：
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