溶血性尿毒综合症与出血性肠炎快速诊断试剂制造技术

本发明专利技术属医学生物学技术领域。使用具有Ｈ７抗原的非０１５７的大肠杆菌菌种；鞭毛抗原Ｕ形管软琼脂诱导，增进鞭毛发育；鞭毛Ｈ７抗原的制备，采用３７℃静止培养６小时，加入０．５％甲醛杀菌；Ｈ７抗原可盛于适宜直径的透明的玻璃管状容器内，无菌分装，每管０．９ｍｌ，盖盖或封口。最佳为长７．５ｃｍ，外径１．２ｃｍ的有盖圆底玻璃管；使用时，启开Ｈ７抗原管，加入病者疑视未稀释血清０．１ｍｌ，混匀，置５０℃静止水浴２小时，见有白色絮状凝集，上部液体清澄，即为Ｈ７阳性，可诊断ＨＵＳ或出血性肠炎。如无凝集，液体仍为浑浊，即为阴性。如在出血性肠炎早期，阴性者可三天后再抽血重测一次。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一.概述大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli)俗称大肠杆菌，寄居于正常人体及哺乳动物的肠道，是人体的正常菌群，对人体无害，也广泛存在于自然环境中。但有若干种大肠杆菌能引起人的疾病，统称为病原性大肠杆菌(Pathogenic E.coli)，其中有一类能产生Vero细胞毒素，称为产Vero细胞毒素大肠杆菌(Verocytoxin-producing E.coli，VTEC)。Vero细胞毒素是致病的主要毒性物质，广泛存在于许多血清型中，但O157:H7几乎是唯一能引起出血性肠炎的VTEC，到目前为止也唯有O157:H7大肠杆菌能引起大规模的出血性肠炎爆发流行，因此将能产生Vero细胞毒素的大肠杆菌O157:H7称为肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)。EHEC O157:H7引起的出血性肠炎常并发溶血性尿毒综合症(Hemolytic uremicsyndrome，HUS)，临床上的主要表现为肾功能衰竭，严重威胁人的生命。二.诊断现状出血性肠炎根据临床症状和体症不易确诊，大多数开始症状并不严重，出血不多，容易误诊，特别是散发病例更易忽视。确诊出血性肠炎主要依靠细菌学诊断，从腹泻粪便中分离细菌。一旦分离到大肠杆菌O157:H7即可确诊出血性肠炎，随后发生的HUS的病因也可清楚。在大多数情况下，由于EHEC排菌期短，排菌量少以及其他技术条件的限制而没有分离到病原菌，诊断不明确，目前临床上尚没有满意的实验室诊断方法。三.专利技术的技术原理1.出血性肠炎病者血清中存在H7抗体大肠杆菌具有菌体(O)抗原，荚膜(K)抗原与鞭毛(H)抗原。O与K抗原均为多糖，免疫原性差，不易刺激机体产生特异性抗体，而H抗原是蛋白质，具有良好的免疫原性。根据作者的研究，H抗原引起抗体效价常是O，K抗原的20-160倍，在EHEC O157:H7感染引起出血性肠炎时，在O，K抗原尚未引起明显抗体的情况下，H抗原即可产生与凝集原起可见反应的H抗体。在病程早期病者血清中大肠杆菌H7抗体的出现为出血性肠炎的免疫学诊断指标提供了可能。2.H7抗原的特异性根据作者研究，大肠杆菌的鞭毛抗原十分特异，与其他肠杆菌科细菌没有交叉，大肠杆菌有H1-H56的53个H抗原(标准中缺了三个)，具有H7抗原的大肠杆菌占大肠杆菌的0.1％-0.2％，而引起出血性肠炎的大肠杆菌目前主要为O157:H7一个血清型。这就为病人血清中的H7抗体作为免疫学诊断指标的特异性提供了依据。3.H7抗原的凝集特性在具体测定方法(下述)中，使用了非O157的H7菌种作为诊断原，避免了血清中万一出现的O157抗体的干扰。另外使用的H7抗原，虽为全菌体，含有O、K抗原，应用H7在50℃，2小时内即发生凝集，而O，K抗原的凝集则需16小时以上，而予以区别；而且H凝集呈特殊的棉花团样絮状，而有别于O，K抗原的颗粒样或片状凝集。H抗原的凝集特性为本专利技术的快速特异提供保证。四.技术方法1.菌种选择使用具有H7抗原的非O157菌种，常用为U5/41株，抗原式1:1:7；F8188/41株，抗原式19ab:？:7；14097株，抗原式153:-:7；和3219-54株，抗原式18ac:77(B21):7。2.鞭毛抗原诱导主要增进鞭毛发育，在0.15％-0.3％琼脂U形管中诱导传代各2代。3.鞭毛H7抗原的制备三角瓶营养肉水100ml在37℃孵箱放置过夜，次日将鞭毛诱导的U形管中的菌种接种于预热的三角瓶营养肉水中，37℃静止培养6小时后，加入甲醛溶液使其最终浓度为0.5％，经杀菌试验合格后即可使用。4.H7抗原分装H7抗原可盛于适宜直径的透明的玻璃管状容器内，无菌分装，每管0.9ml，盖盖或封口。透明塑料管轻，在水浴时易漂浮，如能固定亦可使用；圆底安瓿也可代用。最佳为长7.5cm，外径1.2cm的有盖圆底玻璃管。5.使用启开H7管(如为封口安瓿，启开口后可敞开口使用)，加入病者疑视血清0.1ml，混匀，置50℃静止水浴2小时，期间不能触动试管，影响凝集形成。因此建议在此期间不必提取试管观察，2小时后轻轻取出，见有白色絮状凝集，上部液体清澄，即为H7阳性，可诊断HUS或出血性肠炎。如无凝集，液体仍为浑浊，即为阴性。如在出血性肠炎早期，阴性者可三天后再抽血重测一次。肠出血性大肠杆菌O157:H7引起的人出血性肠炎常并发溶血性尿毒综合症，临床上的主要表现为肾功能衰竭，严重威胁人的生命。目前临床上尚没有满意的实验室诊断方法。本专利技术利用患有出血性肠炎时，机体对大肠杆菌的菌体抗原，荚膜抗原尚未引起明显抗体的情况下，鞭毛(H)抗原即可产生与凝集原起可见反应的H抗体。在病程早期病者血清中大肠杆菌H7抗体作为出血性肠炎的早期免疫学诊断指标；也利用大肠杆菌的鞭毛抗原的特异性，与其他肠杆菌科细菌没有交叉，具有H7抗原的大肠杆菌仅占大肠杆菌的0.1％-0.2％，而引起出血性肠炎的大肠杆菌目前主要为O157:H7一个血清型。这就为病人血清中的H7抗体作为免疫学诊断指标的特异性提供了依据；同时使用了非O157的H7大肠杆菌菌种作为诊断原，避免了血清中万一出现的O157抗体的干扰，也利用大肠杆菌H抗原的凝集特性，虽然使用的H7抗原为全菌体，含有O、K抗原，但在50℃，2小时内仅H抗原发生凝集，而O，K抗原的凝集则需16小时以上，而予以区别；而且H凝集呈特殊的棉花团样絮状，而有别于O，K抗原的颗粒样或片状凝集。H抗原的凝集特性为本专利技术的快速特异提供保证。具体技术方法是使用具有H7抗原的非O157的大肠杆菌菌种；鞭毛抗原U形管软琼脂诱导，增进鞭毛发育；鞭毛H7抗原的制备，采用37℃静止培养6小时，加入0.5％甲醛杀菌；H7抗原可盛于适宜直径的透明的玻璃管状容器内，无菌分装，每管0.9ml，盖盖或封口。最佳为长7.5cm，外径1.2cm的有盖圆底玻璃管；使用时，启开H7抗原管，加入病者疑视未稀释血清0.1ml，混匀，置50℃静止水浴2小时，见有白色絮状凝集，上部液体清澄，即为H7阳性，可诊断HUS或出血性肠炎。如无凝集，液体仍为浑浊，即为阴性。如在出血性肠炎早期，阴性者可三天后再抽血重测一次。权利要求1.患者血清中大肠杆菌H7抗体作为HUS和出血性肠炎免疫学诊断指标。如在本专利后出现以H7抗体为HUS和出血性肠炎的免疫学诊断指标的任何试验和方法都认为与本专利技术有关。2.本专利技术采用非O157的H7大肠杆菌菌种作为抗原来源。3.本专利技术使用单管凝集方法，出现絮状凝集可判定为阳性。全文摘要本专利技术属医学生物学
使用具有H7抗原的非0157的大肠杆菌菌种；鞭毛抗原U形管软琼脂诱导，增进鞭毛发育；鞭毛H7抗原的制备，采用37℃静止培养6小时，加入0.5％甲醛杀菌；H7抗原可盛于适宜直径的透明的玻璃管状容器内，无菌分装，每管0.9ml，盖盖或封口。最佳为长7.5cm，外径1.2cm的有盖圆底玻璃管；使用时，启开H7抗原管，加入病者疑视未稀释血清0.1ml，混匀，置50℃静止水浴2小时，见有白色絮状凝集，上部液体清澄，即为H7阳性，可诊断HUS或出血性肠炎。如无凝集，液体仍为浑浊，即为阴性。如在出血性肠炎早期，阴性者可三天后再抽血重测一次。文档编号G01本文档来自技高网...

【技术保护点】
患者血清中大肠杆菌Ｈ７抗体作为ＨＵＳ和出血性肠炎免疫学诊断指标。如在本专利后出现以Ｈ７抗体为ＨＵＳ和出血性肠炎的免疫学诊断指标的任何试验和方法都认为与本专利技术有关。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨正时，
申请(专利权)人：杨正时，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]