一种用于肝细胞癌早期诊断的分子制造技术

一种用于肝细胞癌早期诊断的分子－－雌激素受体β，其特征在于：在表达ＨＢｓＡｇ的肝细胞肿瘤中过度表达。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及利用转基因动物寻找肝细胞癌发生早期的分子事件。具体地，本专利技术利用外源目基因定位整合致肝细胞癌小鼠模型进行分析，找到肝细胞癌发生早期的分子事件，从而找到可用于肝细胞癌早期诊断和靶向治疗的分子标记物。
技术介绍
肝细胞癌(HCC)是全球最主要的恶性肿瘤之一，尤其是在包括中国在内的亚太地区。全世界每年发生HCC的患者超过100万人(1)，5年存活率低于5％。HCC发生和发展与多种致病因素有关，尤其与乙型肝炎病毒(HBV)感染密切相关。HBV是环状部分双链的DNA病毒，全长约3.2kb。HBV复制过程中以RNA拷贝为中间体，HBV具有随机整合到宿主基因组中的能力，整合了HBV的宿主称为携带者。携带者中都有病毒表面抗原(HBsAg)的表达，携带者呈现非症状的慢性感染。估计全世界至少有三亿五千万HBV慢性携带者(2)，75％以上的HBV慢性携带者分布在亚洲和西太平洋地区(3)。其中至少约20％有不同程度的慢性肝炎和肝硬化，部分最后可演变为原发性肝癌。中国是HBV的高携带区，携带率约为10-20％。临床及流行病学研究显示，HBV慢性携带者患HCC的风险高达40-50％。临床上，肝细胞癌最好的治疗手段仍然是在肝癌早期手术切除，因此早期诊断显得至关重要。至今还没有发现易于检测的血清和肝脏分子标记物，可用于尽早检测出可能会发生HCC的携带者。进一步研究HBV导致HCC发生的病理过程及其分子机制对于此类肝癌的早期诊断具有重要的意义。肝细胞癌的发生与发展是多因素参与的复杂变化过程，涉及到多种基因的异常表达或突变及其彼此间的相互作用。HBV病毒感染及其基因表达产物与肝细胞蛋白或核酸分子的相互作用，可干扰正常的基因表达和信号转导，并可能激发原癌基因的异常表达，或在功能上灭活肿瘤抑制基因，从而导致肝细胞的非正常生长和分化，最终导致肝细胞癌变。流行病学调查表明，男性发生肝细胞癌的比例显著高于女性(4)，提示肝细胞癌的发生可能与性激素密切相关。我们利用基因打靶将乙型肝炎病毒的表面抗原基因(HBsAg)和X基因(HBx)定位整合到小鼠染色体的p21位点上，成功建立了肝细胞癌的小鼠模型(8)。统计发现，表面抗原基因的转基因小鼠15-24月龄，雄性小鼠发生肝细胞癌的比例为58.33％，而雌性小鼠不发生肝细胞癌。X基因转基因小鼠在18个月后，发生肝细胞癌，雌雄小鼠发生肝细胞癌的比例差别不明显。雌激素受体β是Mosselman(5)和Kuiper(6)等相继克隆出来的一种新型的雌激素受体。雌激素受体β在人及其它高等动物的许多组织与细胞中都有分布，但在不同组织与细胞中含量相差很大，甚至在同一细胞的不同区域的分布也有很大差别。如在胎儿的睾丸、卵巢、肾上腺以及脾脏中雌激素受体β的mRNA含量丰富，而在垂体、皮肤、肾和大脑皮层中含量较低或极低。1997年，Tremblay(7)等成功地克隆了小鼠的雌激素受体β。小鼠的雌激素受体β主要分布于小鼠的前列腺、卵巢、睾丸、肺、乳腺、骨、尿道、中枢神经系统和心血管系统等。雌激素受体β可能与睾丸及附睾的发育、前列腺癌的发生及乳腺癌的发生等多种生理和病理现象密切相关。
技术实现思路
本专利技术涉及一种肝细胞癌发生早期的诊断分子的发现，它包括以下步骤①肝细胞癌小鼠模型的建立，具体步骤参见文献(8)； ②设计PCR反应的引物；③利用步骤2获得的PCR反应的引物进行PCR扩增；④将步骤3获得的PCR产物连入pGEM-T Easy Vector中；⑤小鼠肝脏及肿瘤RNA的提取；⑥Northern Blot分析。附图说明图1显示了雌激素受体βPCR示意图。1、1kb ladders；2、野生型小鼠肝脏；3、HBsAg转基因小鼠肝脏；4、HBX转基因小鼠肝脏；5、小鼠睾丸；6、阴性对照。图2显示了雌激素受体β携带载体的构建示意图。1、1kbladders；2-7、不同的细菌克隆。图3显示了雌激素受体β在15-24月龄小鼠肝脏及肿瘤分布示意图。1、野生型(♂)；2、野生型(♀)；3、p21HBsAg/+(♂)；4、3的肿瘤；5、p21HBsAg/+(30月，♀)；6、5的肿瘤；7、p21HBsAg/+(♀)；8、p21HBsAg/HBsAg(♂)；9、8的肿瘤；10、p21HBsAg/ HBaAg(♀)；11、p21HBsAg/HBsAg(30月，♀)；12、11、的肿瘤；13、p21HBx/+(♂)；14、p21HBx/+(♂)；5、14的肿瘤；16、p21HBx/HBx(♂)；17、p21HBx/HBx(♀)。本专利技术的第一方面是构建小鼠肝细胞癌的动物模型，具体步骤见文献(8)。本专利技术的第二方面是制备雌激素受体β的cDNA片段，包括以下步骤利用Trizol提取小鼠睾丸中的总RNA，将1μg小鼠睾丸总RNA反转录成cDNA。以小鼠睾丸cDNA为模板，用引物1(5’-GGTATCATTACGGTGTCTGGT-3’)和引物2(5’-CTGTCACTGCGTTCAATAGGT-3’)扩增出831bp的雌激素受体β的cDNA片段，将cDNA片段连入pGEM-T Easy Vector中，测序正确后，用EcoRI进行酶切，回收850bp左右的片段。本专利技术的第三方面是利用Northern Blot检测雌激素受体β在小鼠的表达情况，具体方法如下用Trizol提取小鼠肝脏及肿瘤的总RNA，取20μg总RNA进行琼脂糖甲醛变性胶电泳，通过毛细转移法将RNA转移到硝酸纤维素膜上。以雌激素受体β基因片段为探针进行Northern blot杂交，发现雌激素受体β基因在HBsAg转基因小鼠的肝脏肿瘤有表达，而在野生型小鼠的肝脏、HBsAg转基因小鼠的肝脏、HBx转基因小鼠的肝脏及肿瘤均未发现雌激素受体β基因的表达。本专利技术人利用HBV的表面抗原基因(HBsAg)及X基因(HBx)定位整合致肝细胞癌小鼠(8)进行分子生物学分析。通过Northernblot杂交检测了不同年龄阶段野生型小鼠的肝脏及转基因小鼠肝脏及肿瘤的雌激素受体β基因的表达情况。发现雌激素受体β基因仅在HBsAg转基因小鼠的肝脏肿瘤有表达，而在野生型小鼠的肝脏、HBsAg转基因小鼠的肝脏、HBx转基因小鼠的肝脏及肿瘤均未发现雌激素受体β基因的表达。说明雌激素受体β与HBV的表面抗原基因(HBsAg)引起的肝细胞癌密切相关，为HBV的表面抗原基因(HBsAg)相关的肝细胞癌的诊断及治疗提供了可能的靶分子。本文中所提到的对比文献的全部内容均引入本文以供参考。以下通过实施例进一步详细说明本专利技术。但是，这些实施例并不构成对本专利技术保护范围的任何限定。实施例1小鼠组织总RNA的提取1、将小鼠组织(肝脏和睾丸等)100mg放入2ml Trizol中，用匀浆器进行匀浆，于室温培养5分钟。2、加入0.4ml氯仿，盖紧瓶盖剧烈振荡15秒，放置2-3分钟。2-8℃，10000-12000g离心15分钟。3、将上层水相转移到一个新的离心管中，加入1ml异丙醇，混匀，室温放置10分钟，2-8℃，10000-12000g离心10分钟。4、弃上清，加入至少2ml 75％的异丙醇洗涤，2-8℃，不大于7500g离心5分钟。5、弃上清，空气干燥5-10分钟，加入无RNase的水500μl，反复抽本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晓，王友亮，崔芳，黄翠芬，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：