分泌型肺炎链球菌蛋白质制造技术

描述了肺炎链球菌新的蛋白质，及其编码核酸序列。还描述了它们在疫苗和筛选方法中的应用。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及源自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的蛋白质、编码这些蛋白质的核酸分子、上述核酸和/或蛋白质作为抗原/免疫原和在检测/诊断中的用途，以及筛选蛋白/核酸序列作为可能的抗菌靶标的方法。肺炎链球菌，通常称为肺炎球菌，是一种重要的致病生物。肺炎链球菌感染在发展中国家和发达国家与人类疾病持续重要的关系已有权威性的论述(Fiber，G.R.，Science，2651385-1387(1994))。这篇文章指出，在世界范围内，该细菌被认为是急性呼吸系统感染最常见的致病菌，估计每年造成一百万儿童死亡，多数在发展中国家(Stansfield，S.K.，Pediatr.Infect.Dis.，6622(1987))。在美国，肺炎球菌仍被认为是细菌性肺炎最常见的致病因素(Breiman等人，Arch.Intern.Med，1501401(1990))，该病的发病率在幼童、老年人及处于诱病因素状态的患者中尤其高，诸如无脾、心脏、肺和肾脏疾病患者，糖尿病、酒精中毒病人或者免疫抑制失调者，尤其是艾滋病人。这些人群发生肺炎球菌败血症以至脑膜炎的风险很高，因此死于肺炎球菌感染的风险很大。据信美国每年有超过50,000例侵入性肺炎球菌患者(脑膜炎和菌血症)。肺炎球菌还是中耳炎和鼻窦炎最主要的致病菌，在发达国家儿童中该菌仍然流行感染，这导致重大的代价。仅在美国一个国家，在两岁以下儿童中大概有七百万例肺炎链球菌引起的中耳感染。由于最近出现了青霉素抗性菌株，因此更加需要有效预防肺炎球菌感染的措施。据报道，美国12个州的13家医院的肺炎球菌分离物中，有6.6％具有青霉素抗性，其中一些分离株还对其它抗生素具有抗性，包括第三代环孢菌素(Schappert，S.M.，Vital and HealthStatistics of tge Centres for Disease Control/National Centrefor Health Statistics，2141(1992))。在一些医院，青霉素抗性的发生率甚至更高(高达20％)(Breiman等人，J.Am.Med.As soc.，2711831(1994))。在青霉素一直作为肺炎球菌有效的治疗药物几十年后，由于其抗性菌株在近期的突然出现，因此这些发现被认为是一种警示。综上所述，有必要考虑提高肺炎球菌疾病的预防、控制、诊断或治疗方法。多种方法用于提供预防肺炎球菌感染的疫苗。例如，鉴于肺炎球菌有多种血清型(至少90种)，因此存在多种困难，血清型是根据包裹菌体的多糖荚膜的结构划分的。对一种血清型有效的疫苗对其它血清型无效，这意味着对大多数病例有效的疫苗必须包含全部血清型的多糖抗原。另一个出现的问题是，当纯化的荚膜多糖(每一种荚膜多糖都决定着血清分型并是主要的保护抗原)用做疫苗时，在两岁以下儿童中诱导保护性抗体反应并不可靠，而这个年龄群患上侵入性肺炎球菌感染和脑膜炎的机率却最高。为诱导增强的免疫应答，尤其是T细胞依赖性的免疫应答，一种改进的使用荚膜抗原的方法将多糖与蛋白质缀合。这种方法已经用于针对流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的疫苗的开发。但是有关多种多糖疫苗和以缀合物为基础的疫苗的成本的问题仍然存在。另外，由于缀合物疫苗提供的血清型覆盖面有限，因此这种疫苗组合物应当根据地区和人群的不同加以改变。由于施用载体蛋白质总剂量相对较大，还可能出现载体诱导的免疫抑制或过载的问题。第三种方法是寻找有潜力成为疫苗候选物的其它抗原性成分。这是本专利技术的基础。利用一种专门开发的细菌表达系统，我们能够从肺炎球菌中鉴定出一组蛋白质抗原，它们与菌体外膜相关或由菌体分泌。因此，本专利技术首先提供了一种肺炎链球菌的蛋白质或多肽，其具有选自表1所示的序列。本专利技术的蛋白质或多肽可以基本上纯的形式提供。例如，它可以基本上不含其它蛋白质的形式提供。如在此所讨论的，本专利技术的蛋白质和多肽可用作抗原性物质。这些物质具有“抗原性”和/或“免疫原性”。一般情况下，“抗原性”是指该蛋白质或多肽能用于产生抗体，或者实际上能在受试者体内诱导抗体反应。“免疫原性”是指该蛋白质或多肽能在受试者体内激发保护性的免疫应答。因此，在后一种情况下，该蛋白质或多肽不仅能产生抗体反应，而且，能产生不依赖抗体的免疫应答。技术人员应当理解，本专利技术蛋白质或多肽的同源物或衍生物同样可应用于本专利技术，即用作抗原性/免疫原性物质。例如，包含一个或多个添加、缺失、取代等的蛋白质或多肽包括在本专利技术的范围内。另外，可以将一个氨基酸用另一个相似“类型”的氨基酸取代。例如用一个疏水性的氨基酸替换另一个疏水性的氨基酸。技术人员可以使用程序，例如CLUSTALTM程序进行氨基酸序列比较。该程序能比较氨基酸序列并通过在两个序列的合适位置插入空格而找出最佳的比对。对于一个最佳比对，可计算出氨基酸的一致性或相似性(一致性加上氨基酸类型的保守性)。象BLASTX这样的程序，能比对出最长的相似序列，并给出相似性的分值。因此就有可能得到一组对比序列，它们之间有几个相似的区域，每个相似区域都有不同的分值。本专利技术考虑了上述两种一致性分析。对于同源物和衍生物，它们保留的原蛋白质或多肽的抗原性或免疫原性的程度，比它们与此处描述的蛋白质或多肽的一致性程度更重要。但是，提供了合适的同源物或衍生物，其与此处描述的蛋白质或多肽至少要有60％的相似性(如前所述)。优选，提供的同源物或衍生物至少有70％相似性，更优选，至少有80％的相似性。最优选，提供的同源物或衍生物至少有90％或者甚至95％的相似性。在另一研究中，同源物或衍生物也可是融合蛋白，融合部分可使纯化更加容易，例如通过有效地给目的蛋白质或多肽加标签。在使用时可能需要移去“标签”，或者融合蛋白本身保留了足够有用的抗原性。另一方面，本专利技术还提供蛋白质或多肽，或其同源物或衍生物的抗原性/免疫原性片段。对于此处描述的蛋白质或多肽，或其同源物或衍生物的片段，情况略有不同。众所周知，可以筛选抗原性蛋白或多肽来确定抗原表位区，即那些引起蛋白质或多肽抗原性或免疫原性的区域。本领域的技术人员熟知这些筛选方法。所以，本专利技术中的片段应当包含一个或多个这样的表位区，或者与这些区域有足够高的同源性，以保持抗原性/免疫原性。因此，本专利技术中的片段可与一致性无关，因为它们可能只与此处描述的蛋白质或多肽，同源物或衍生物的特定部分100％一致。再次指出，关键是这些片段还保持着抗原性/免疫原性。对于同源物、衍生物和片段，重要的是它们至少具有一定程度的其所源自的蛋白质或多肽的抗原性/免疫原性。本专利技术的蛋白质可利用基因克隆技术以基本上纯化的形式提供。这些技术已经公开，例如在例如在J.Sambrook等人，MolecularCloning 2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中。因此，第二方面，本专利技术还提供包含或由下述序列构成的核酸分子(i)表1列出的任何DNA序列或其RNA等同物；(ii)与(i)中任何序列互补的序列；(iii)与(i)或(ii)中序列编码相同蛋白质或多肽的序列；(iv)与(i)、(ii)和(iii)中的任何序列基本相同的序列；本文档来自技高网...

【技术保护点】
肺炎链球菌蛋白质或多肽，其序列选自表１所示序列。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：RWF勒佩吉，D巴德考克，PJH斯泽，K皮克，JM韦尔斯，SB汉尼菲，
申请(专利权)人：微生物技术有限公司，普罗瓦利斯英国有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[]