S140G突变型KCNQ1蛋白及其在筛选离子通道抑制剂和促进剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种突变型ＫＣＮＱ１，即Ｓ１４０Ｇ－ＫＣＮＱ１。还公开了利用ＫＣＮＱ１来筛选心肌ＫＣＮＱ１钾离子通道的抑制剂的方法，它包括步骤：（ａ）将（ｉ）表达ＫＣＮＱ１表达载体和（ｉｉ）ＫＣＮＥ１表达载体或ＫＣＮＥ２表达载体转入哺乳动物细胞；（ｂ）在转化的哺乳动物细胞的培养基中，添加候选物质，并测定添加前后的电生理钾离子流，其中，如果加入候选物质后的电生理钾离子流减小，则表明该物质是心肌ＫＣＮＱ１钾离子通道的抑制剂。该方法可快速筛选治疗房颤的候选药物。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学和医学领域，更具体地本专利技术涉及家族性房颤病人KCNQ1基因的增效突变及其应用。
技术介绍
根据世界卫生组织的定义，心房颤动(atrial fibrillation)是心房不规则的、杂乱无章的电活动，心电图上P波消失，代之以基线上形状、大小、方向和时程不一的颤动波，在没有高度或完全性房室传导阻滞情况下心室率完全不等。心房颤动是临床上最常见的心律失常之一，它促发心力衰竭或血流动力学障碍，诱发室速或室颤等致命性心律失常，导致血栓和栓塞事件，增加基础心脏病的死亡率，心房颤动本身还可以引起心脏扩大。根据统计，美国心房颤动发生率为0.9％。随着年龄的增长，心房颤动发生率激剧增高，在65岁以上者则高达5.9％。根据Framinham研究，老年人(＞65岁)卒中1/3由心房颤动引起。欧洲心房颤动发生率与美国相仿，亚洲略低。心房颤动严重地危害着人类的健康，也给社会带来了相当的经济负担。作为心房颤动的特殊类型，特发性心房颤动指无明碗的心脏病变基础的心房颤动。其命名比较混乱，其他的名称有孤立性特发性心房颤动、良性特发性心房颤动和家族性特发性心房颤动。多达三分之一的心房颤动归类为特发性心房颤动(Lip GYH，Beevers DG(1995)ABC of atrial fibrillationhistory，epidemiology，and importance of atrial fibrillation. BMJ 3111361)。房颤(AF)作为人类一种常见的心律失常，它的分子致病基础至今没有被很好的阐明。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种导致房颤的分子致病机理，该机理就是KCNQ1基因发生了致病突变(S140G)，从而导致心肌钾离子IKs离子通道的离子流增大。本专利技术的另一目的就是提供了基于该分子致病机理的药物筛选方法。在本专利技术的第一方面，提供了一种筛选心肌KCNQ1钾离子通道的抑制剂的方法，包括步骤(a)将α亚基表达载体和β亚基表达载体转入哺乳动物细胞，获得转化的哺乳动物细胞，其中α亚基表达载体是KCNQ1表达载体，而β亚基表达载体选自下组KCNE1表达载体或KCNE2的表达载体；(b)在步骤(a)的转化的哺乳动物细胞的培养基中，添加候选物质，并测定添加候选物质前后的电生理钾离子流，其中，如果加入候选物质后的电生理钾离子流减小，则表明该活性物质是心肌KCNQ1钾离子通道的抑制剂。在一优选例中，所述的KCNQ1表达载体表达野生型的KCNQ1。在另一优选例中，所述的KCNQ1表达载体表达突变型的KCNQ1。更佳地，所述的KCNQ1表达载体表达S140G突变型的KCNQ1。在另一优选例中，所述的β亚基表达载体表达KCNE1。在另一优选例中，所述的β亚基表达载体表达KCNE2。在另一优选例中，步骤(b)中的测定方法为膜片钳法。在本专利技术的第二方面，提供了一种筛选心肌KCNQ1钾离子通道的促进剂的方法，包括步骤(a)将α亚基表达载体和β亚基表达载体转入哺乳动物细胞，获得转化的哺乳动物细胞，其中α亚基表达载体是KCNQ1表达载体，而β亚基表达载体选自下组KCNE1表达载体或KCNE2的表达载体；(b)在步骤(a)的转化的哺乳动物细胞的培养基中，添加候选物质，并测定添加候选物质前后的电生理钾离子流，其中，如果加入候选物质后的电生理钾离子流增大，则表明该活性物质是心肌KCNQ1钾离子通道的促进剂。在本专利技术的第三方面，提供了一种S140G突变型KCNQ1蛋白的用途，它被用于筛选心肌KCNQ1钾离子通道的抑制剂或促进剂。附图说明图1显示S140G-KCNQ1/KCNE1离子通道的离子流，比野生型KCNQ1/KCNE1离子通道的离子流有极大的增大。图2显示S140G-KCNQ1/KCNE2离子通道的离子流，比野生型KCNQ1/KCNE2离子通道的离子流有极大的增大。图3显示了色原烷醇293B对S140G-KCNQ1/KCNE1离子通道的抑制效果。图4显示了色原烷醇293B对S140G-KCNQ1/KCNE2离子通道的抑制效果。图5显示了色原烷醇293B对KCNQ1/KCNE2离子通道的抑制效果。具体实施例方式本专利技术人经过广泛而深入的研究，对一个中国遗传性房颤家系的病人进行了遗传分析，通过全基因组扫描把致病位点定位在11p15.5，并在该区域的KCNQ1基因中找到了一个致病突变S140G。KCNQ1基因编码心肌钾离子通道IKs(KCNQ1/KCNE1)、KCNQ1/KCNE2、KCNQ1/KCNE3离子通道的α亚基。该突变存在于所有的病人中，不存在于正常人中。为了阐明这种突变的发病机制，本专利技术人进一步做了突变体离子通道流分析。功能分析表明S140G突变增强KCNQ1/KCNE1、KCNQ1/KCNE2离子通道的离子流。这与先前发现的引起LQT综合症的KCNQ1突变不同，引起LQT综合症的KCNQ1突变降低KCNQ1/KCNE1、KCNQ1/KCNE2离子通道的离子流。动物实验与临床研究结果表明大多数房颤是由心房肌电传导多元折返形成， 而动作电位持程和有效不应期的缩短有利于多元折返形成。本专利技术发现的房颤突变S140G引起IKs离子通道(KCNQ1/KCCNE1)与KCNQ1/KCNE2通道的功能的增强，这些增强可以引起心房肌动作电位持程与有效不应期的缩短，从而引发房颤。基于以上结果，针对KCNQ1/KCNE2离子流的离子通道抑制剂，可能对房颤及其他心律失常有缓解，治疗效果。因此，本专利技术还提供了一种筛选治疗房颤的候选药物的方法，即筛选心肌KCNQ1钾离子通道的抑制剂的方法，它包括步骤(a)将α亚基表达载体和β亚基表达载体转入哺乳动物细胞，获得转化的哺乳动物细胞，其中α亚基表达载体是KCNQ1表达载体，而β亚基表达载体选自下组KCNE1表达载体或KCNE2的表达载体；(b)在步骤(a)的转化的哺乳动物细胞的培养基中，添加候选物质，并测定添加候选物质前后的电生理钾离子流，其中，如果加入候选物质后的电生理钾离子流减小，则表明该活性物质是心肌KCNQ1钾离子通道的抑制剂。如本文所用，术语“野生型KCNQ1”指具有SEQID NO1所示氨基酸序列的蛋白。KCNQ1编码心肌钾离子IKs离子通道，KCNQ1/KCNE2及KCNQ1/KCNE3离子通道中的α亚基。如本文所用，术语“S140G-KCNQ1”指具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白，其对应的编码序列如SEQID NO9所示。发生S140G时，SEQ ID NO9中核苷酸418由A→G，SEQ ID NO2中140位氨基酸由S→G。功能分析表明S140G突变使KCNQ1/KCNE2、KCNQ1/KCNE3的离子流增大，这与原先发现的导致LQT综合症的突变的离子流降低效应相反。所以S140G突变可能通过缩短心房肌的动作电位持程(Action Potentia1 Duration，APD)与有效不应期(Effective Refratory Period，ERP)来引发与维持房颤。如本文所用，术语“KCNE1”指GenBank NM_000219序列编码的蛋白，即Potassium(K)ChaNnel ClassE，Member 1。如本文所用，术语“KCN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种筛选心肌ＫＣＮＱ１钾离子通道的抑制剂的方法，其特征在于，包括步骤：　　　　（ａ）将α亚基表达载体和β亚基表达载体转入哺乳动物细胞，获得转化的哺乳动物细胞，其中α亚基表达载体是ＫＣＮＱ１表达载体，而β亚基表达载体选自下组：ＫＣＮＥ１表达载体或ＫＣＮＥ２的表达载体；　　　　（ｂ）在步骤（ａ）的转化的哺乳动物细胞的培养基中，添加候选物质，并测定添加候选物质前后的电生理钾离子流，　　　　其中，如果加入候选物质后的电生理钾离子流减小，则表明该活性物质是心肌ＫＣＮＱ１钾离子通道的抑制剂。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈义汉，徐世杰，黄薇，徐文渊，谢陪俐，
申请(专利权)人：同济大学，国家人类基因组南方研究中心，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]