一种人多囊蛋白－１定量检测试剂盒，其组成如下： （１）９６孔酶标板１块，已包被抗人多囊蛋白－１Ｎ端单克隆抗体ＭＡ７Ｂ１； （２）样品稀释液１瓶，５ｍｌ，其为含０．０５％吐温－２０和１％牛血清白蛋白的ＰＢＳ缓冲液； （３）检测抗体工作液１瓶，１０ｍｌ，其含抗人多囊蛋白－１Ｎ端多克隆抗体ＰＡＰＣ１ １μｇ／ｍｌ； （４）酶标抗体工作液１瓶，１０ｍｌ，其含辣根过氧化物酶标记的羊抗兔ＩｇＧ； （５）底物稀释液１瓶，２０ｍｌ，其含ｐＨ５．０磷酸盐－柠檬酸盐缓冲液和过氧化氢； （６）终止液１瓶，５ｍｌ，为２Ｍ Ｈ↓［２］ＳＯ↓［４］； （７）洗涤液（２０×）１瓶，５０ｍｌ，其为含１．０％吐温－２０的ｐＨ７．４磷酸盐缓冲液； （８）标准品２管，每管含ＰＣ－１－ｅ２冻干粉４００ｎｇ； （９）邻苯二胺片３片，每片２ｍｇ； （１０）坐标纸１张。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学免疫学检测
，是一种用于定量检测人体液中多囊蛋白-1含量的双抗体夹心ELISA试剂盒。
技术介绍
常染色体显性遗传性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)是人类最常见的致死性单基因遗传病之一，累及所有种族，在世界范围的发病率为1/500~1/1000，在全球约有1300万人受累。其特征是双侧肾囊肿呈进行性发生并增大，疾病逐渐进展，常在患者中年后期即发展为终末期肾衰竭。ADPKD引起的肾衰竭占肾脏替代治疗患者总数的10％以上。这种囊性疾病危害甚大，不仅发生在肾脏，也常累及肾外器官，引发多囊肝、胰管及胆管扩张、结肠憩室、颅内动脉瘤、心脏瓣膜异常等。国际上至今对ADPKD的临床诊断指标还没有统一标准，多根据家族史、临床表现，结合影像学检查结果做出诊断。患者常因常规体检的影像学检查发现本病，发现时肾脏囊肿往往已非常明显。基因诊断结果确切可靠，但技术条件、辅助检查设备要求较高，操作繁琐，目前临床上还没有一个ADPKD的体液诊断指标，迫切需要一个简单、方便、易于推广、敏感和特异的临床诊断ADPKD的检测方法。
技术实现思路
鉴于ADPKD是由于16号染色体的PKD1基因和(或)4号染色体的PKD2基因突变引起的，其85~90％的发生系由于PKD1的编码产物——多囊蛋白-1(PC-1)的结构和功能异常所致。所以，可以通过定量检测体液中PC-1的含量，初步诊断ADPKD。PC-1是一个分子量约460kD的跨膜糖蛋白，由1个庞大的胞外区(N端)、11个跨膜区和1个相对小的胞浆尾(C端)组成。胞外区所拥有的众多复杂的蛋白基序决定了PC-1的胞外部分对其行使正常的生理功能的重要性。本专利技术从胞外区的N端着手对PC-1进行检测。本专利技术利用抗人多囊蛋白-1 N端单克隆抗体和抗人多囊蛋白-1 N端多克隆抗体，采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)方法，制备了双抗体夹心PC-1-ELISA试剂盒，用该试剂盒定量检测人体液中PC-1的含量。通过比较体液中PC-1含量的差异判断是否患ADPKD，为及早防治该病提供一个重要的参考依据。本专利技术试剂盒的主要试剂为抗PC-1 N端单克隆抗体MA7B1(已包被在酶标板上)和抗PC-1 N端多克隆抗体PAPC1，用于制备两种抗体的抗原均为PC-1胞外区N端融合蛋白PC-1-e2，该融合蛋白对应于PC-1的第46~202位氨基酸残基。通过检测样品中PC-1 N端的含量，就可以代表PC-1在受检样品中的水平。本专利技术试剂盒组成如下1.96孔酶标板1块，其已包被抗人PC-1 N端单克隆抗体MA7B1，包被浓度5μg/ml。2.样品稀释液1瓶，5ml，其为含0.05％吐温-20和1％牛血清白蛋白的PBS缓冲液。3.检测抗体工作液1瓶，10ml，其含抗人PC-1 N端多克隆抗体PAPC1 1μg/ml。4.酶标抗体工作液1瓶，10ml，其含辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG。5.底物稀释液1瓶，20ml，其含pH5.0磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液和过氧化氢(H2O2)。6.终止液1瓶，5ml，其为2M H2SO4。7.洗涤液(20×)1瓶，50ml，其为含1.0％吐温-20的pH7.4磷酸盐缓冲液。8.标准品2管，每管含PC-1-e2冻干粉400ng。9.邻苯二胺(OPD)片3片，每片2mg。10.坐标纸1张。本专利技术试剂盒酶标板和各试剂的制备以及用本试剂盒检测人体液样品中PC-1含量的方法详见具体实施方式部分。具体实施例方式人PC-1定量检测试剂盒中各试剂的制备及来源1.标准品蛋白即融合蛋白PC-1-e2的制备标准品蛋白为人PC-1 N端融合蛋白PC-1-e2冻干粉，该蛋白对应于人PC-1胞外区N端的flank-LRR-flank区和部分WSC区的第46∽202位氨基酸残基，纯度在97％以上。该标准品蛋白的制备过程详见2003年9月25日申请的专利技术专利“人多囊蛋白-1 N端融合蛋白PC-1-e2”，专利申请号为03151184.8。现将其制备过程简述如下(1)制备人肾组织总RNA取新鲜的健康成人肾组织，用上海华舜公司总RNA抽提试剂盒，按常规的异硫氰酸胍法提取总RNA。(2)合成引物根据已知的人类PKD1 cDNA序列(GenBank L33243)，设计并合成引物。正向引物 其5′端引入BamH I酶切位点 反向引物 其5’端引入Hi ndIII酶切位点 (3)RT-PCR扩增PKD1e2基因以人肾组织总RNA为模板，用上述引物通过RT-PCR扩增编码PC-1 N端flank-LRR-flank区和部分WSC区的PKD1 cDNA序列PKD1e2基因，其全长474bp。(4)构建表达载体pQE30-PKD1e2和工程菌M15/pQE30-PKD1e2将融合蛋白表达载体pQE30(德国Qiagen公司产品，其阅读框的5′端含连续编码6个组氨酸的核苷酸序列)和PKD1e2基因分别用BamH I和HindIII双酶切，将两种酶切产物胶回收后用T4DNA连接酶连接，然后转化感受态大肠杆菌M15，其转化子重组质粒通过BamHI/HindIII双酶切和DNA序列分析鉴定，重组表达载体为pQE30-PKD1e2，工程菌为M15/pQE30-PKD1e2。(5)融合蛋白PC-1-e2的诱导表达工程菌M15/pQE30-PKD1e2在LB培养基中37℃培养过夜，以1∶20体积比接种在2×YT培养基中，继续培养至OD600值为0.5~0.6，加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mM/L，32℃诱导表达4~5小时。经破菌和Ni-NTA Agarose纯化后，行SDS-PAGE电泳，显示表达的融合蛋白分子量为19.0kD，即为融合蛋白PC-1-e2。(6)融合蛋白PC-1-e2的纯化及SDS-PAGE分析4℃离心收集步骤(5)诱导表达后的菌体，经8M/L尿素裂解液(pH8.0)充分裂解后离心，将上清与50％Ni-NTA Agarose(德国Qiagen公司产品)混合，用8M尿素pH梯度缓冲液(pH6.3，pH5.9，pH4.5)洗涤并洗脱融合蛋白PC-1-e2。12％SDS-PAGE分析融合蛋白PC-1-e2，经蛋白薄层扫描分析，该融合蛋白占菌体总蛋白的47.11％。(7)融合蛋白PC-1-e2的冻干分装将纯化的融合蛋白PC-1-e2用Lowry法定量，分装于数个1.5ml塑料离心管中，使每管PC-1-e2含量为400ng，然后用冻干机冻干至成为冻干粉，置4℃保存。2.样品稀释液的配制样品稀释液为含0.05％吐温-20和1％牛血清白蛋白的磷酸盐(PBS)缓冲液(pH7.4)。其配制方法如下(1)配制PBS缓冲液(pH7.4)NaCl8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4□12H2O 2.9gKCl 0.2g双蒸水 加至 1000ml调pH值至7.4(2)配制含0.05％吐温-20和1％牛血清白蛋白的PBS缓冲液吐温-20 500μl牛血清白蛋白 10gPBS 加至 1000ml分装成5ml/瓶，置4℃保存。3.酶标抗体工作液的配制辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，购自美国Sigma公司。将该抗体原液用本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：梅长林，赵海丹，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：
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