一种用竟争酶联免疫吸附试验检测犬狂犬病毒总抗体试剂盒，其特征在于所述试剂盒的组成为： 已预包被狂犬病毒抗原的酶标板 ８×１２孔 酶结合物 ５ｍｌ 阳性血清 ０．２ｍｌ 阴性血清 ０．２ｍｌ 浓缩洗涤液 １０ｍｌ 底物Ａ ５ｍｌ 底物Ｂ ５ｍｌ 终止液 ５ｍｌ 其中，所述的酶结合物为辣根过氧化酶－抗狂犬病毒单克隆抗体酶结合物；浓缩涤液为含０．０５％吐温－２０的生理盐水；底物Ａ为３．３′－５．５′－四甲基联苯胺溶液；底物Ｂ为双氧水溶液；终止液为用蒸馏水稀释后的１ｍｏｌ／ＬＨ↓［２］ＳＯ↓［４］硫酸溶液，纯硫酸与蒸馏水比例为１∶１７。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测试剂盒，具体地是一种用竟争酶联免疫吸附试验(ELISA)检测犬狂犬病毒总抗体试剂盒及制备方法。
技术介绍
实验动物是生命科学的重要基础和必备的支撑条件之一。实验动物质量的优劣不仅直接关系到相关科研工作的成败，而且也是一个国家总体相关科研水平的重要标志。实验动物的质量保证除了依赖于饲养管理水平和硬件条件外，还依赖于标准化的检测系统，而检测系统的关键是科学、先进的检测方法和标准化的检测试剂。目前，我国实验动物检测标准与体系尚不完备、不统一、不规范、不标准，与国外发达国家相比也有很大差距，这对我国总体相关科学研究的发展是一大障碍。随着经济的发展和人民生活水平的提高，宠物犬的数量在不但增加，犬的活动区域也在不断扩大，仅武汉市区就有十万只以上。从宠物医疗市场得到的信息，人们是迫切希望了解宠物接种狂犬疫苗后对犬是否具有保护力，而目前狂犬病毒抗体的检测工作因受检测条件和费用的限制，并没有得到广泛的应用。狂犬病毒(Rabies Virus)是狂犬病的病原体，而我国又是狂犬病的高发国家，居世界第二位(仅次于印度)，由于狂犬病是人畜共患性疾病，95％的狂犬病是与人类密切接触的犬传播的，其危害已经引起政府和人民的高度关注。犬不仅用于狩猎(猎犬)、侦破(警犬)、看门、食肉和作为宠物饲养，犬还是进行生命科学、医学、药学、化工、农业、军事、环保、航天及生物工程领域应用广泛的重要实验动物(实验犬)之一。随着我国在生命科学、医学、药学等研究领域发展速度加快，实验犬的使用量不断增大，质量要求不断提高，实验犬的生产基地在不断涌现，但实验犬的检测体系尚未建立，使得狂犬病的危害更加突出，保证犬(尤其是实验犬)的质量和工作人员的身体健康与生命安全成为十分突出的课题。特别是我国进入WTO后，我国生命科学的研究成果、医药、生物制品以及实验犬等将跨出国门走向世界，这些均需要实验犬的质量检测工作标准化作为支撑，以突破发达国家设立的技术壁垒，进入国际市场。目前，国内外用ELISA方法检测人血清中抗狂犬病毒抗体，辅助临床上狂犬病的诊断和用于狂犬疫苗效果的评价方法已经成熟。但用于实验动物(包括犬、猴、鼠等)狂犬病毒抗体检测的方法和相应的试剂盒尚未见实验动物狂犬病毒抗体检测方法的研究报道，也未见相应的试剂盒商售。因此建立科学、快速、先进的实验动物狂犬病毒抗体检测方法，按规范程序生产相应的标准化试剂盒是当务之急。本专利技术所要解决的技术问题是提供一种抗狂犬病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒及其制备方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是一种抗狂犬病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒，其组成为已预包被狂犬病毒抗原的酶标板 8×12孔酶结合物(HRP-抗狂犬病毒N蛋白McAb) 5ml阳性血清 0.2ml阴性血清 0.2ml浓缩洗涤液10ml底物A(TMB)5ml 底物B(H2O2) 5ml终止液(2mol/L H2SO4)5ml其中，所述的酶结合物为辣根过氧化酶—抗狂犬病毒单克隆抗体酶结合物；浓缩涤液为含0.05％吐温-20的生理盐水；底物A为3.3′-5.5′-四甲基联苯胺溶液；底物B为双氧水溶液；终止液为用蒸馏水稀释后的1mol/LH2SO4硫酸溶液，纯硫酸与蒸馏水比例为1∶17。制备上述检测试剂盒的方法为A辣根过氧化酶(HRP)-抗狂犬病毒单克隆抗体酶结合物的制备鼠抗狂犬病毒核蛋白(N蛋白)单克隆抗体(McAb)制备与辣根过氧化酶(HRP)标记将抗狂犬病毒N蛋白的腹水McAb(由武汉生物所细胞工程室提供)经1次50％、2次33％饱和硫酸铵沉淀提纯；用改良过的过碘酸氧化法标记HRP；酶标记物(代号HRP-抗N)中加入1％BSA和50％甘油，-20℃-30℃保存备用；B阳性血清的制备挑选体格健壮的6月龄比格犬2～3只，初次免疫用兽用五联苗，加强免疫用人用狂犬苗，待犬血清中抗狂犬病毒IgG抗体酶联免疫吸附试验效价达1∶500以上，即可采血分离血清；用A液将冻存的阳性血清稀释至O.D值＜0.1，即为所需阳性血清；C阴性血清的制备用A液将冻存的阴性血清作适当稀释至O.D＞0.5，即为所需阴性血清；D浓缩洗涤液的制备将氯化钠(NaCl)170g；吐温(Tween)-2010ml；蒸馏水1000ml配制成所需的生理盐水浓缩洗涤液；E底物A的制备将3.3′-5.5′-四甲基联苯胺270g、无水乙醇240ml、甘油6ml、双蒸水340ml配制成3.3′-5.5′-四甲基联苯胺溶液；F底物B的制备将Na2HPO4·12H2O的磷酸氢二钠18.41g、无水Na2HPO4的磷酸氢二钠7.33g、枸橼酸5.10g、双蒸水1000ml及原装33％的双氧水1.0ml配制成所需双氧水溶液；G终止液的制备所述终止液为用蒸馏水稀释后的硫酸溶液，纯硫酸与蒸馏水为1∶17；H预包被板的制备将狂犬病毒抗原用0.05mol/L，pH9.6的磷酸缓冲液即包被液稀释成5μg/ml包被酶标板，每孔100μl，4℃过夜；倒掉包被液，每孔加含10％小牛血清的封闭液4℃过夜；倒掉封闭液，吹干，4℃保存备用；将上述制备好的酶结合物用A液稀释、与浓缩洗涤液、底物A、底物B、终止液、阳性血清、阴性血清按上述试剂盒中组成的定量分装，再与预包被板分装成检测试剂盒。所述的狂犬病毒抗原是用狂犬病毒疫苗株在Vero细胞上培养、扩增，经冻融，超声波破碎、差速离心提取，-20℃保存，作为包被用狂犬病毒用抗原。所述的包被液即0.05mol/L，pH9.6的磷酸缓冲液制备方法为将碳酸钠(Na2CO3)1.59g、碳酸氢钠(NaHCO3)2.93g、叠氮钠(NaN3)0.20g、蒸馏水1000ml配制而成。所述的封闭液制备方法为将氯化钠(NaCl)8.5g、小牛血清(BSA)10.0g、双蒸水500ml、甘油500ml配制而成，其中，先将氯化钠和小牛血清溶于双蒸水中，再加甘油。所述A液制备方法为将对乙酰氨基酚(APAP)1.5g，聚乙二醇2万(P)10g，小牛血清(BSA)2g，吐温(Tween)-20 1ml，硫柳汞0.2g和0.02mol/L、pH7.2的盐酸缓冲盐水1000ml配制而成。本专利技术试剂盒检测程序取待检血清样本、阳性对照血清和阴性对照血清各50μl加入孔中，再加酶结合物(HRP-抗N工作浓度1∶1000)50μl，置37℃反应60分钟；洗板5次，滴加底物A、B液各50μl，37℃反应15分钟，用酶标检测仪检测O.D450值。结果判断Cutoff＝(阴性对照平均O.D450值+阳性对照平O.D450值)/2。样本O.D450≤Cutoff值判为阳性。试剂盒质量标准的制定及检定特异性20份阴性血清、20份阳性血清，检测符合率不低于95％。灵敏性抗体阳性血清50μl(即直接取样本血清50μl加到反应孔中)能检出。精密性变异系数(C·V)≤15％。将同一份血清同步作10孔所得O.D450值，经统计学处理，计算C·V值。稳定性将试剂盒置37℃不少于3天与4℃存放的试剂盒同步检测10样品，其O.D450值的总变化率≤25％。试剂的现场试用用本专利技术试剂检测正常人群中抗狂犬病毒抗体从本院门诊部随机抽取健康体检人员血清93份，按检测程序进行抗体检测。用本专利技术试剂检测狂苗免疫犬体内总抗体的动态变化本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐国景，张瑜，唐利军，肖红雨，张金明，孙凡中，易平，杨文祥，林乔，龚镇奎，
申请(专利权)人：湖北省预防医学科学院，
类型：发明
国别省市：
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