一种体外薄层纤溶活性检测胶板、其制备及应用方法技术

一种体外纤溶活性检测胶板，其特征在于以聚合于亲水的玻璃板或透明胶片上的薄层聚丙烯酰胺作载体，内含纤维蛋白。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种医药及生物
中用于药物生物活性的检测设备、制备及应用方法，更具体地，涉及一种可用于体外检测药物或物质纤溶活性的胶板、制备及应用方法。
技术介绍
纤溶活性检测是发现和评价纤溶药物的关键技术，主要有体内和体外方法。体内方法结果准确、可靠，但操作复杂、成本较高，不适合纤溶活性的初步测定、高通量药物筛选和纤溶药物质量控制等。体外检测主要有纤维蛋白平板法(fibrin plate assay)、底物法(substrate method)和凝块溶解法(clotlysis assay)。多数体外方法操作较简单，大量用于科学研究、纤溶药物质量控制及临床检验中。凝块溶解法是在含凝血酶与纤溶酶原的溶液中加入纤维蛋白原，使溶液凝固成块，随后加入待检测的纤溶酶原激活物如链激酶、尿激酶等，激活纤溶酶原成纤溶酶，使凝块溶解，凝块溶解时间与纤溶酶原激活物活性成反比。此法灵敏度较低，只适用于测定纤溶酶原激活物含量较高的样品。底物法是将待测物与一定的底物混合作用一段时间，用光吸收值的变化表示纤溶活性，此法专一灵敏，尤其是发色底物法可检测出低于10-11mol/L的纤溶酶，但是发色底物(如S-2251)十分昂贵，操作复杂，限制了其应用。纤维蛋白平板法大体可分为传统方法和改进方法。传统方法纤维蛋白平板法首先将纤维蛋白原与凝血酶混匀，然后加入预熔化的45℃保温的琼脂糖，快速混匀倒入透明的玻璃或塑料平皿，冷却后得到半透明的胶状平板，做好的平板应无气泡产生，无可见纤维蛋白聚集。在做好的平板上打孔，加入待测样品，37℃保温、保湿一段时间，若纤维蛋白降解则在样品孔周围形成透明圈，透明圈大小与纤溶活性呈正相关，实际操作时也用人血清和琼脂混合制备成半透明的胶状平板，但重现性较差。改进纤维蛋白平板法目的有三个，一是提高灵敏度；二是明确判定激酶活性和纤溶酶活性；三是满足特殊实验要求，简化实验操作。张守峰等测定组织纤溶酶原激活物活力时，加入纤溶酶原使灵敏度提高了30倍，最低可检测出0.01ng(约0.001IU)的组织纤溶酶原激活物。郑铃等测定组织纤溶酶原激活物活力时，不加琼脂，直接将纤维蛋白原、纤溶酶原和凝血酶混匀制成平板，其灵敏度比加入琼脂糖的纤维蛋白平板提高约500倍，尿激酶浓度在2.5×10-5-1.6×10-2IU之间其活性大小的对数与溶圈直径呈良好线性关系。在对照平板中加入纤溶酶抑制剂氨基己酸(EACA)，抑制纤溶酶活性，可观察到是否有其他蛋白酶降解纤维蛋白形成的透明圈。但当对照平板和无EACA的平板都有溶圈时，此方法并不能判定究竟是其他蛋白酶单独作用降解纤维蛋白形成透明圈，还是与组织纤溶酶原激活物共同作用形成透明圈。纤维蛋白平板中纤维蛋白含量通常以加入的纤维蛋白原的量计算。纤维蛋白原与适量的凝血酶混匀(凝血酶的具体用量取决于其活力和纤维蛋白原的量，可参考凝血酶产品说明)，可溶的纤维蛋白原在凝血酶作用下形成不溶的纤维蛋白。纤溶活力有多种表示方法，一般是在同一平板上加入一组已知活力的标品，用标品透明圈垂直两直径乘积mm2的对数为纵坐标，标品活力对数为横坐标，做标准直线、求回归方程，或者在双对数坐标纸上作标准直线，将样品透明圈垂直两直径乘积mm2代入即得待测样品活力。一般来讲，纤维蛋白平板法成本相对较低，可用于定量分析，灵敏度满足大多数实验要求，是目前最常使用的纤溶活性体外检测方法。但是常规的纤维蛋白平板制作过程中需要严格控制纤维蛋白原与熔化琼脂的混合温度，琼脂熔解后易凝固，且琼脂抗张强度低，无法大量制备和保存统一规格的薄层平板，不适合纤溶活性的低成本高通量精确定量分析。聚丙烯酰胺凝胶的制备方法成熟可靠，凝胶的抗张强度比琼脂高。在制备胶板时所用丙烯酰胺贮液中，N，N’-亚甲双丙烯酰胺和丙烯酰胺的配比可为1∶20-30，一般使用的配比为1∶29，不同的配比对所形成凝胶的孔径有影响。另一影响凝胶孔径的因素是丙烯酰胺和双丙烯酰胺两种成分总的含量，依据配比不同，可使用两种成分和的浓度为3.5-20％。丙烯酰胺贮液通常含有30％的两种成分。催化凝胶聚合的过硫酸铵和N，N，N’，N’-四甲基乙二胺用量取决于丙烯酰胺和双丙烯酰胺两种成分的配比和浓度、反应溶液的含氧情况、以及聚合反应温度，具体数据极易从相关科学书籍中获得。
技术实现思路
在常规纤维蛋白平板法的基础上，使用聚合于亲水的玻璃板或透明胶片上的薄层聚丙烯酰胺作载体，制作可严格控制纤维蛋白含量和胶厚度的规格统一的纤维蛋白胶板，并用蛋白染色法指示纤维蛋白降解情况，专利技术了一种低成本和灵敏的，可用于高通量精确定量分析的体外纤溶活性检测胶板。具体方法是将低温保存的纤维蛋白原、凝血酶、丙烯酰胺贮液加入冰浴的中性缓冲液中，再加入适量的四甲基乙二胺、过硫酸铵、迭氮钠或其他防腐剂混和均匀，灌入制胶模具中，在室温或30℃聚合。制作的聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板厚度范围为0.1-0.5mm，可在4℃保湿条件下放置一个星期，保湿封装的含有0.05％迭氮钠防腐剂的胶板至少可保存一年，使用时可随样品数量和体积不同剪取适当大小的胶板。将0.5-20μL待测样品溶液直接点在胶板上，37℃保湿温育4-12小时后，用蒸馏水冲洗3-5次，用考马斯亮蓝或硝酸银染色指示纤维蛋白降解情况。本专利技术的最大特点是使用薄层聚丙烯酰胺凝胶代替琼脂糖作介质，不溶的纤维蛋白在凝胶内均匀地形成。当丙烯酰胺、双丙烯酰胺、纤维蛋白原及凝血酶在低温条件下混合均匀或纤维蛋白原及凝血酶预先混合，灌入厚度均匀的模具中后，在常温条件下，纤维蛋白原被凝血酶水解失去活性肽后形成不溶的纤维蛋白，丙烯酰胺和双丙烯酰胺在四甲基乙二胺和过硫酸铵催化下聚合成聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯酰胺的机械性能比琼脂糖好，可制作出纤维蛋白分布均匀的薄层胶板，纤溶结果可以用染色剂指示，不但节省试剂降低了分析成本，而且所需样品少，重现性好，RSD达3.83％。蚓激酶浓度在1×10-2mg/mL-5mg/mL之间时，蚓激酶浓度的对数与其产生的透明圈直径平方的对数成良好的线性关系，R值达0.9997(见图2)。本方法具有较高的灵敏度和准确性，至少可以观察到25ng的蚓激酶产生的纤维蛋白水解圈，比常规的纤维蛋白平板法的灵敏度高数百倍。附图说明图1显示蚓激酶标准溶液在薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板上形成的透明圈其中a0.5mg/mL纤维蛋白，5％丙烯酰胺；b0.5mg/mL纤维蛋白，10％丙烯酰胺；c0.5mg/mL纤维蛋白，15％丙烯酰胺；1-15蚓激酶浓度分别为10，5，1，5×10-1，1×10-1，5×10-2，1×10-2，5×10-3，1×10-3，5×10-4，1×10-4，5×105，1×105，5×105，1×106mg/mL，点样量5μL；16缓冲液对照，点样量5μL。图2显示蚓激酶浓度对数与透明圈直径的算术平均数的平方的对数所作的曲线其中，折线蚓激酶浓度对数与透明圈直径的算术平均数的平方的对数所作的曲线；直线Origin5.0作的回归直线。注胶板含0.5mg/mL纤维蛋白，10％丙烯酰胺；胶板大小10cm×5cm×0.45mm图3显示几种待研究样品在薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板上形成的透明圈其中胶板含1.6mg纤维蛋白/mL，10％丙烯酰胺，0.05％迭氮钠，胶板厚度0.45mm本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：潘映红，郭宝林，赵明，郭翠娟，陈红，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：