一种用于诊断早期卵巢癌的四粘蛋白酶联免疫检测试剂盒制造技术

一种用于诊断早期卵巢癌的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于它由一种卵巢癌蛋白标志物四粘蛋白标准品、多克隆抗体包被板、辣根过氧化物酶标记的四粘蛋白多克隆抗体、质控品和辅助试剂组成。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本本专利技术属于医学和生物学检测领域，具体而言，本专利技术涉及一种用于诊断早期卵巢癌的酶联免疫检测试剂盒，即本专利技术提供了一种卵巢癌蛋白标志物四粘蛋白(即Tetranectin，简称TN)检测试剂盒，可用于卵巢肿瘤的良、恶性诊断，特别是早期卵巢癌的检测，以及粘液性卵巢上皮癌的检测；也可用于卵巢癌术后化疗效果的监测及预后评估。卵巢癌在全世界范围一直是妇科肿瘤中治愈率最低、死亡率最高的恶性肿瘤。目前卵巢癌在我国妇科癌症中的发病率已由八十年代占第三位而上升为第一位。约有80％以上的卵巢癌初诊患者到晚期(III期或IV期)，即使立刻手术，术后五年生存率也仅仅不到15％，卵巢癌手术预后的不良结局近五十年以来几乎没有改善。由于卵巢癌的发病机理至今仍不请楚，因此很难采取有效的预防措施。为了降低卵巢癌的危害，关键仍在早期发现、早期治疗。虽然基础和临床研究已经发现了一些卵巢癌的肿瘤标志物，如糖链抗原125(CA125)、癌胚抗原(CEA)、组织多肽抗原(TPA)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSA)和抑制素等，但真正提供给临床使用的并不多。近年来即使在有条件的医院里仍然多以CA125单项指标作为卵巢癌诊断、术后化疗监测及预后评估的参考依据。由于CA125也用于其他恶性肿瘤的检测，因此对卵巢癌并不是特异性指标。而且CA125只在浆液性卵巢癌患者血清中有升高，对非浆液性卵巢癌、尤其是粘液性卵巢癌则没有反应。CA125对早期卵巢癌也不敏感。CA125作为检测卵巢癌的唯一指标显然是不能满足临床需要的。本专利技术的目的正是为了解决目前临床上使用单项CA125作为卵巢癌诊断指标的不足，将TN作为一种新的蛋白标志物用于卵巢癌的早期诊断和粘液性卵巢上皮癌的诊断，并且提供了操作简便、准确灵敏的检测试剂盒和测定方法，从而可以提高卵巢癌的捡出率，以便临床上能尽早采取有效的综合治疗方案，达到提高存活率、降低死亡率的目的。因此，本专利技术的目的是提供了一种用于诊断早期卵巢癌的酶联免疫检测试剂盒。本专利技术的上述目的是通过下列技术方案实施的一种卵巢癌蛋白标志物四粘蛋白(即Tetranectin，简称TN)酶联免疫检测试剂盒，其特征在于它由TN标准品、多克隆抗体包被板、辣根过氧化物酶(HRP)标记多克隆抗体、质控品和辅助试剂组成。本专利技术试剂盒的制作方法包括标准品的制备、多克隆抗体包被板的制作、酶标多克隆抗体的制备、质控品的制备以及辅助试剂的配制。本专利技术试剂盒中的TN标准品是从人血浆中提取制备的。一种制备步骤包括收集正常血浆(经HIV、肝炎病毒、梅毒、AIDS等测定均为阴性者)，低温贮存备用；上述血浆经饱和硫酸铵沉淀、离子交换层析和亲和层析三个步骤进行TN的分离纯化，后两步层析的顺序可以变换，本专利技术试剂盒使用的一种TN纯化顺序依次为饱和硫酸铵沉淀、离子交换层析和亲和层析；将获得的TN纯品按试剂盒的标准曲线最高点浓度进行稀释，然后进行分装、冷冻干燥，即获得TN标准品。本专利技术试剂盒中的多克隆抗体包被板可用TN纯品对兔或鼠免疫而获得的多克隆抗体包被酶标板而制作。本专利技术试剂盒中的多克隆抗体包被板是用TN纯品对小鼠免疫而获得的鼠抗人多克隆抗体包被酶标板而制作的。酶标板可选用国产板或进口板；规格可以是96孔平板或12×8、6×8可拆条板。本专利技术试剂盒采用一种进口酶标板(Costar公司产品)。一种多克隆抗体包被酶标板的制作步骤如下a)制备多克隆抗体用TN纯品按常规对Balb/c小鼠进行免疫后，再在腹腔内注射小鼠骨髓瘤细胞SP2/0；收集腹水经重组Protein G预装层析柱纯化后即获得TN多克隆抗体；b)包被将上述多克隆抗体用0.05M碳酸盐缓冲液稀释后加入酶标板各孔，每孔100ul，吸附过夜，用吐温磷酸盐缓冲液洗板，再用吐温磷酸盐缓冲液封闭过夜，甩干后晾干，即获得多克隆抗体包被酶标板。本专利技术试剂盒中的酶标多克隆抗体是用辣根过氧化物酶(HRP)标记TN多克隆抗体而制备的。一种酶标多克隆抗体的制备步骤如下a)在纯化好的TN抗体溶液中加入SATA溶液，在室温反应0.5小时；b)加入去乙酰化溶液，室温孵育2小时；c)用脱盐柱分离出去乙酰化SATA衍生物(即多抗)和副产品(盐酸羟胺)；d)将上述多抗溶液与用马来酰胺(Maleimide)活化的HRP在室温反应1小时，即获得HRP酶标多克隆抗体。本专利技术试剂盒中的质控品是用混合人血清，按照本试剂盒的标准曲线范围要求进行稀释而调配制备的。本专利技术试剂盒采用的一种质控品制备方法包括如下步骤a)收集正常人血清(经HIV、肝类病毒、AIDS、梅毒等测定均为阴性者)，于-20℃保存；b)将积累的各个血清混合，用ELISA方法测定TN浓度，并按标准曲线要求，将两份混合血清的浓度分别调至10±2ng/ml、50±10ng/ml范围；c)将步骤b)所获得的两份血清按每个试剂盒的需要量分装，冷冻干燥，即制备成低、高值质控品。本专利技术试剂盒中的辅助试剂包括酶联反应底物溶液，显色液，反应终止液和清洗缓冲液。一种配制辅助试剂的方法如下a)底物溶液磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.0)配制的3％过氧化氢溶液；b)显色液四甲基联苯胺(TMB)甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml；c)反应终止液2M硫酸d)清洗缓冲液(20倍浓缩液，20X)PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液。本专利技术试剂盒的测定方法，其特征在于它依次按下述步骤进行a)抗原-抗体反应在试剂盒提供的抗体包被板的微孔中分别加入100μl已稀释好的不同浓度的标准品、质控品，或待测血清样品，37℃水浴保温60分钟；然后用清洗缓冲液(1X)重复洗板4次。b)酶联反应将HRP-多克隆抗体溶液加入各孔，每孔100μl，37℃水浴保温60分钟。重复洗板操作4次。c)显色反应每孔依次加入底物溶液、显色液各50μl，37℃水浴保温10分钟，每孔再加入50μl反应终止液结束反应。d)比色以空白对照孔的吸光值调零，用酶标仪在450nm测定OD值并记录。e)结果计算A.制作标准曲线以标准品浓度为横坐标，标准品测定的OD值为纵坐标，作出标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0.98时本次测定有效；B.评判质控品浓度根据质控品的OD值，从标准曲线上读取相应的浓度值；当低值质控品、高值质控品的浓度均在给定范围内时，本次测定判为有效；C.计算待测血清样品浓度当标准曲线和质控品均被判定有效时，根据待测样本的OD值从标准曲线计算出待测血清样品的TN浓度。与已有的卵巢癌检测指标CA125相比较，本专利技术试剂盒具有以下优点a)本专利技术试剂盒以TN作为早期卵巢癌的诊断指标，克服了CA125对早期卵巢癌的不敏感性，在I期卵巢癌患者中仅有50％患者的血清CA125水平异常升高；而TN在I期～IV期卵巢癌患者中都呈现异常下降。b)CA125对浆液性卵巢上皮癌的阳性捡出率可达80％以上，然而对粘液性卵巢上皮癌没有反应；本专利技术试剂盒克服了单项CA125检测卵巢癌存在较高假阴性的不足，TN不但可以捡出浆液性卵巢上皮癌，而且对粘液性卵巢上皮癌同样有效。TN单独使用或与CA125联合使用，能够有效地提高早期卵巢癌的捡出率，尤其可提高粘液性卵巢上皮癌的捡出率。下面用实施例进一步说明本专利技术。应该理解的是，本专利技术的实施例是用于说明本专利技术而不是对本专利技术的限制。根据本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马旭，吴尔若，
申请(专利权)人：马旭，
类型：发明
国别省市：