提供识别包括淀粉样蛋白β(Aβ)关联肽APP669‑711的、N末端从APP669开始的肽(将其总称为APP669‑x)的抗体。还提供使用该抗体测定APP669‑x的方法。提供可以以高灵敏度检测及定量分析对象多肽的夹心免疫测定法。一种APP669‑x N末端识别单克隆抗体，其特异性识别APP669‑x肽的N末端。一种免疫测定法，其包括：使用特异性识别APP669‑x肽的N末端的APP669‑x N末端识别单克隆抗体，使试样中的APP669‑x和上述APP669‑x N末端识别单克隆抗体反应而测定APP669‑x。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】特异性识别APP669-x的N末端的抗体及免疫测定法
本专利技术涉及阿尔茨海默病领域中的免疫学测定方法。更详细而言，本专利技术涉及识别包括淀粉样蛋白β(Aβ)关联肽APP669-711的、N末端从APP669开始的肽(将其总称为APP669-x)的抗体、以及使用该抗体测定APP669-x的方法。另外，本专利技术属于微量成分和感染微生物抗原等的临床检查药、生化研究及免疫学研究等领域，还涉及利用特异性免疫反应的夹心型免疫测定法。更详细而言，本专利技术还涉及在检测及定量试样中的微量多肽时有用的夹心型免疫测定法。
技术介绍
阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease；AD)是痴呆症的主要原因，占痴呆症整体的50-60％。据推断，在2001年已达2400万人以上的全世界痴呆症患者数，将在2040年达到8100万人。一般认为，阿尔茨海默病的发病与Aβ密切相关。Aβ是如下产生的：作为单次跨膜蛋白的由770个氨基酸残基构成的淀粉样蛋白前体蛋白(APP)由于β分泌酶和γ分泌酶而接受蛋白质分解，从而产生。当由于Aβ的伴有纤维化的凝集而出现老年斑时，以此为诱因，微管相关蛋白(tau蛋白)在神经细胞内凝集、蓄积而引起神经功能障碍、神经细胞死亡。作为其结果，一般认为会引发极度的认知能力下降。众所周知的是，Aβ主要由40mer(Aβ1-40)和42mer(Aβ1-42)构成，还已知其会向脑脊液(CSF)中转移。另外，还显示出也向血液中转移的可能性。另外，近年获知CSF中也存在Aβ1-40和Aβ1-42这样的长度不同的Aβ样肽。<br>关于Aβ，在最近的研究中本专利技术人们报道了作为Aβ关联肽(Aβ样肽)之一的APP669-711与Aβ1-42的比值有望作为血液生物标志物(非专利文献1，专利文献1：国际公开WO2015/178398)。这些Aβ及Aβ关联肽可通过在免疫沉降法(IP)之后进行质谱分析(MALDI-TOFMS)来定量。进一步地，本专利技术人们在专利文献2：国际公开WO2017/047529中公开了：将选自由Aβ及Aβ关联肽(Aβ样肽)的3个比值、即Aβ1-39/Aβ1-42、Aβ1-40/Aβ1-42及APP669-711/Aβ1-42组成的组中的2种以上比值用数学方法组合而成的数值有望作为血液生物标志物。这些Aβ及Aβ关联肽可通过在免疫沉降法(IP)之后进行质谱分析(MALDI-TOFMS)来定量。综上，本专利技术人们发现，使用质谱(MALDI-TOFMS)定量的、作为Aβ关联肽之一的APP669-711与Aβ1-42的比值有望作为血液生物标志物候补。然后，本专利技术人报道了：日本和澳大利亚的多个被检体显示，将该比值APP669-711/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42的比值组合而得的复合生物标志物(compositebiomarker)可以高精度地推断脑内淀粉样蛋白蓄积，为具有可靠性和通用性的生物标志物(非专利文献2)。作为包含APP669-711的Aβ关联肽等生物标志物的分析技术，质谱(MALDI-TOFMS)是有用的。另一方面，作为此外的分析技术，夹心ELISA为广泛且常规地用作临床检查法的测定方法，并且廉价，因此可成为有用的分析技术。目前，各厂商(和光纯药、IBL等)已经在销售能够分析血浆中的Aβ1-40、Aβ1-42的ELISA试剂盒。专利文献3：日本特开2005-170951号公报公开了识别淀粉样蛋白β的N端部(Aβ1-16)的单克隆抗体BAN-52a及BAN-50a、以及特异性识别淀粉样蛋白β的C端部的单克隆抗体BA-27a、BS-85及BC-05a，公开了Aβ1-40、Aβ1-42特异性夹心EIA。专利文献4：日本特开2014-208678号公报公开了特异性识别Aβ11-x的抗体，公开了针对Aβ11-40的夹心ELISA、以及针对Aβ11-x的蛋白质印迹。但是，用免疫学测定方法分析APP669-x的手段尚属未知。免疫测定法是指利用特异性抗原抗体反应测定试样中的分析对象物质的浓度的方法，由于可以特异性且精度良好地测定微量成分而广泛用于临床检查、生化研究等。免疫测定法包括：使用酶作为标记物的酶免疫测定法(EIA)；使用放射性同位素的放射免疫测定法(RIA)；使用化学发光物质的化学发光免疫测定法(CIA)；使用荧光发光物质的荧光免疫测定法(FIA)；使用金属络合物的电化学发光免疫测定法(ECLIA)；使用荧光素酶等生物发光物质的生物发光免疫测定法(BLIA)；用PCR扩增、检测标记在抗体上的核酸的免疫PCR；检测由于形成免疫复合体而产生的浊度的免疫比浊法(TAI)；检测由于形成免疫复合体而凝集的胶乳的胶乳凝集比浊法(LA)；在纤维素膜上进行反应的免疫层析法等。在上述免疫测定法中，将使用识别分析对象物质不同的表位的2种抗体来夹持分析对象物质的方法称为夹心法。例如，夹心ELISA(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay)为EIA的一种，为如下方法：通过固定在96孔板表面的捕捉抗体捕捉分析对象物质，使标记有过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶的检测抗体与该分析对象物质反应，利用标记酶的底物的显色来确定分析对象物质的浓度(例如专利文献5：日本特开平8-220098号公报)。ECLIA中也利用了夹心法，所述夹心法是下述方法：使生物素化的抗体、标记有因电化学变化而发光的钌(Ru)络合物的抗体与分析对象物质反应(例如专利文献6：日本特表2014-509735号公报)。这样，免疫测定法中广泛使用夹心法。作为特异性定量特定的肽片段的方法，也使用夹心法，通过用N末端识别抗体和C末端识别抗体夹持分析对象肽片段的方法来特异性测定肽片段。例如，对于蛋白酶切断淀粉样蛋白前体蛋白(Amyloidprecursorprotein；APP)而生成的Aβ而言，在生物体内存在不同片段的肽。这些中，Aβ1-42作为阿尔茨海默病的脑脊液(CSF)生物标志物而通过ELISA等免疫测定法进行定量(非专利文献3)。专利文献7：日本特开2004-239885号公报报道了下述方法：作为改善免疫测定法的测定灵敏度的方法之一，对于难以从试样中提取的蛋白质，在免疫测定法之前用高浓度的离子型表面活性剂对试样进行提取。现有技术文献专利文献专利文献1:国际公开WO2015/178398专利文献2:国际公开WO2017/047529专利文献3:日本特开2005-170951号公报专利文献4:日本特开2014-208678号公报专利文献5:日本特开平8-220098号公报专利文献6:日本特表2014-509735号公报专利文献7:日本特开2004-239885号公报非专利文献非专利文献1:KanekoN,NakamuraA,WashimiY,KatoT,SakuraiT,ArahataY,BundoM,TakedaA,NiidaS,ItoK,TobaK,TanakaK,YanagisawaK.:Novelplasmabio本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种APP669-x N末端识别单克隆抗体，其特异性识别APP669-x肽的N末端。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180227 JP PCT/JP2018/007295;20180913 JP 2018-1711.一种APP669-xN末端识别单克隆抗体，其特异性识别APP669-x肽的N末端。
2.一种免疫测定法，其包括：使用特异性识别APP669-x肽的N末端的APP669-xN末端识别单克隆抗体，使试样中的APP669-x与所述APP669-xN末端识别单克隆抗体反应而测定APP669-x。
3.根据权利要求2所述的免疫测定法，其中，所述免疫测定法选自由夹心型免疫测定法、直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA、蛋白质印迹、免疫组织学染色、流式细胞术、免疫沉降、亲和层析及免疫细胞染色组成的组。
4.根据权利要求3所述的免疫测定法，其中，在所述夹心型免疫测定法中，使用第1抗体及第2抗体，
所述第1抗体是所述APP669-xN末端识别单克隆抗体；
所述第2抗体是能够识别APP669-x的不同于所述第1抗体所具有的抗原结合部位的部分或APP669-x的片段的C末端的抗Aβ抗体。
5.根据权利要求3所述的免疫测定法，其中，所述第2抗体为能够识别APP669-711的C末端的单克隆抗体或多克隆抗体。
6.根据权利要求3所述的免疫测定法，其中，所述夹心型免疫测定法选自由酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)、化学发光免疫测定法(CIA)、荧光免疫测定法(FIA)、电化学发光免疫测定法(ECLIA)、生物发光免疫测定法(BLIA)、免疫PCR、免疫比浊法(TAI)及胶乳凝集比浊法(LA)组成的组。
7.根据权利要求3所述的免疫测定法，其包括：向所述试样中添加能够结合于APP669-x的抗原亲和性物质。
8.根据权利要求7所述的免疫测定法，其中，向所述试样中添加所述抗原亲和性物质，然后使所述APP669-x肽与所述第1抗体及所述第2抗体反应；或者
在使所述APP669-x肽与所述第1抗体及所述第2抗体反应时向反应体系中添加所述抗原亲和性物质；或者
使所述APP669-x肽与所述第1抗体及所述第2抗体中的任一者反应，然后向反应体系中添加所述抗原亲和性物质，然后使所述APP669-x肽与所述第1抗体及所述第2抗体中的另一者反应。
9.根据权利要求7所述的免疫测定法，其中，所述抗原亲和性物质选自由抗体、肽、低分子化合物及核酸适配体组成的组。
10.根据权利要求2所述的免疫测定法，其中，所述试样为选自血液、脑脊液、尿、粪便及体分泌液组成的组中的生物体源试样。
11.一种APP669-711的夹心型免疫测定用试剂盒，其包含：
第1抗体，其为特异性识别APP669...
【专利技术属性】
技术研发人员：金子直树，
申请(专利权)人：株式会社岛津制作所，
类型：发明
国别省市：日本;JP
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