毛细流定向自组装成环分析方法技术

本发明专利技术涉及一种毛细流定向自组装成环分析方法，属于生化、药物及环境分析技术领域该方法是首先对玻片进行疏水性处理；然后，将样品溶液与选用的辅助成环剂混匀，用微量进样器移取到疏水性玻片表面，放入烘箱烘干，形成自组装环，最后再在显微镜下激发观察测定。该方法用疏水性玻片代替薄膜作为基质，借助辅助成环剂，获得环径很小的自组装环，使溶液中几乎全部溶质都富集在环线上，降低背景干扰，提高测定的灵敏度，利于批量数据的处理。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生化、药物及环境分析
，具体涉及一种用于微量分析的自组装成环分析方法。
技术介绍
自组装是自然界普遍存在的现象。DNA的合成、RNA的转录及调控、蛋白质的合成与折叠等生物化学过程都与自组装相关。更完善、更复杂的生命有机体也都是自组装所形成的产物。另外，自组装在智能材料、自恢复体系、网状传感器等动力学和多组分体系中普遍存在。近年来，科学家对自组装研究产生浓厚兴趣。环状自组装是一类非常特殊的自组装，环的形成对印刷、印染、表面污染防治、清洗和涂敷等表面处理工业、纳米阵列、流体力学的动态过程及固载表面的图纹化会产生影响。生命体中也有这样的环状结构，对它的研究不仅具有仿生学价值，同时还可能获得具有特殊结构的功能材料。在各种生化分析和其它分析领域中，迫切需要具有高灵敏度、高选择性和取样量少的分析方法。经典的滤纸点滴实验是一种具有发展前景的分析方法。但由于部分样品溶液能扩散到滤纸内部，使得该方法缺乏较高的灵敏度。环炉技术是在点滴分析基础上发展起来的一种新的微量分析方。该方法的特点是借助于滤纸的毛细效应，使试样中的待测物质选择性地径向扩散，并在环炉的热阻挡作用下不断浓集，在滤纸上形成一个环带。该方法和在疏水性滤纸上的成环分析法，由于滤纸和所形成环的不均匀性，常常使它们的重现性受到影响。为了克服这一不足，发展了固载表面的成环分析法。Ishida等首次将自组装环技术应用于分析测定。他们发现，在有PVA存在下，o，o’-二羟基偶氮苯和铝离子形成的配合物可以在聚氯乙烯盘上形成一个圆环，但环的直径较大，为10.6mm。借助一个紫外光源，可测定1~30ppb的铝离子，检测限为5.0×10-8M。Kaneko等用自组装环技术，在十八烷基硅烷化硅盘片上用罗丹明B测定了全血中的微量血色素。然而，这两种方法存在的主要问题是薄膜基质的背景干扰很强，影响测定的灵敏度。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有的自组装成环技术在使用过程中存在的上述不足，专利技术了一种新的，用疏水性玻片代替薄膜作为基质，借助辅助成环剂，获得环径很小的自组装环，使溶液中几乎全部溶质都富集在环线上，降低背景干扰，提高测定的灵敏度，利于批量数据的处理。本专利技术目的的实现过程如下(1)首先对玻片进行疏水性处理，其过程如下 将医用载玻片(1.0mm×25mm×75mm)依次浸入下列溶液中用超声波清洗仪进行洗涤家用洗涤剂溶液、铬酸洗液和二次水，用以除去玻璃表面的有机物。每从一种试剂中取出时均以大量水进行冲洗。然后将载玻片浸入硝酸溶液进行活化，然后分别用氢氧化钠溶液和二次水超声洗涤。洗净的载玻片浸入丙酮5min，用氮气吹干。此时再把载玻片浸入新配的4.5％(v/v)二氯二甲基硅烷(DMCS)的甲苯溶液中30min，将载玻片从该溶液中取出，依次浸入氯仿、丙酮中各5min，用氮气吹干备用。(2)将样品溶液与选用的辅助成环剂混匀，其中辅助成环剂选用聚乙烯醇PVA、聚丙烯酰胺PAM、聚乙二醇PEG水溶性聚合物；然后移取体积体积为0.xμl的液滴到疏水性玻片表面，放入60-80℃烘箱2-3min烘干，形成自组装环，再在显微镜下激发观察测定。采用上述方法，当点样体积为0.1-2.0μL时，利用溶剂蒸发和向外的毛细流作用，可以将分析物移到接触线上，并富集形成直径小于1.1mm，环线宽在30μm以下的自组装环，与薄膜基质相比，环直径缩小了近10倍。以下是本专利技术获得的自组装环的定量分析关系当液滴与表面的接触角θ一定时，其半径r与液滴体积V的立方根成正比，即r＝KV1/3(1)其中K=13,]]>是一个与θ有关的函数。实验还发现，SOR环线上溶质的分布较好地符合高斯误差曲线，而最大荧光强度与物质的量成正比Imax=K24πσK1(KV1/3-δ)m=ξm--(2)]]>其中，ξ=K24πσK1(KV1/3-δ),]]>K1是一个与σ和δ有关的积分常数，K2是与荧光物质激发性质有关的常数，K与自组装成环条件有关。利用最大荧光强度Imax与溶液中荧光物质的量m成正比关系。据此可以用于自组装环中荧光物质的定量测定。本方法的优点(1).实验和理论证明，采用本方法，溶剂挥发使溶质向液滴边缘传输，经历了由斑点到圆环的富集，溶液中几乎全部溶质都能富集在环线上，背景干扰低，与环炉分析法相比提高50倍，比斑点分析技术提高近500倍，大大提高了测定的灵敏度，且由于环较小，利于批量数据的处理。(2).与其它薄膜基质上成环技术相比，来源于溶液的基质效应(背景干扰)降低。该方法已可以成功地用于核酸、蛋白质、环境和药物分析，检测限达到飞摩尔到阿摩尔量级。可以预见，它将成为一种灵敏度高的固相分析方法并在药物、环境、分离科学和生命科学研究等领域显示出更大的优越性和更广泛的实用性。(3).耗样量小(纳升到微升级)，可以形成很小的环。如果伴以点样机器人、激光诱导荧光和CCD阵列检测新技术，可以平行处理大批量的数据。对开发具有高通量、高效率的微阵列分析技术具有十分重要的意义。目前生物芯片制备方法中多采用接触点加样法和喷墨法，与液滴在固载表面上的蒸发过程有关。然而由于人们对液滴在固载表面上蒸发过程的认识还不是十分成熟，目前对大部分生物芯片的处理是采用阵列斑点分析而不是自组装成环分析，没有考虑溶质应在环线上集聚且使环线上溶质分布均匀。如果在芯片构建过程中利用毛细流作用将溶质完全沉积在环线上，用最大荧光强度替代现在总荧光强度，采用多环的线性扫描代替面积扫描积分，不仅可以大大提高方法的灵敏度，而且可以加快数据处理的速度，简化设备要求，提高信号的强度。(4).在PVA-124等高分子辅助剂存在下，毛细流可将生物大分子特别是DNA分子拉伸，我们初步试验了拉伸的生物大分子酶解进行光学定位，并拟对蛋白质亚单元和分子微区结构进行光学表征，或者将拉伸后的生物大分子经过接触扩散进行转移印迹，开展蛋白质的免疫分析和核酸的杂交研究。可以预见，将在快速、精确的基因组物理图谱的绘制、基因定位及有序测序方面发挥更大的作用。(5).由于自组装环具有孔径分布均匀和尺寸可控制的特点，有可能作为一种新型的气、液膜固定介质，从而改善和提高现有分离膜的分离性能。同时也有可能作为一种新型的色谱填料在生化分离领域中获得应用；另外，自组装环的研究已经为表面处理工业、分子图案组装、纳米粒子界面组装和流体力学的动态过程等提供了丰富的信息并在分析领域得到应用。我们将本专利技术方法应用到药物、蛋白质、核酸和环境样品分析中，绝对检测限达到飞摩尔到阿托摩尔级，见表1。表1.SOR技术在生化、药物和环境分析中的应用 具体实施方式第一组实施例.利用药物自身荧光强度，采用荧光显微自组装成环技术(SOR)对盐酸小檗碱、荧光素钠、羟甲香豆素等药物进行定量分析。实施例1利用SOR技术测定盐酸小檗碱首先，对玻片进行疏水处理将医用载玻片依次浸入家用洗涤剂溶液、铬酸洗液中用超声波清洗仪进行洗涤，用以除去玻璃表面的有机物，每从一种洗液中取出时均以大量水进行冲洗，然后再用二次水溶液进行超声清洗；将载玻片浸入硝酸溶液进行活化本文档来自技高网...

【技术保护点】
毛细流定向自组装成环分析方法，包括以下步骤：（１）．对玻片进行疏水性处理；（２）．将样品溶液与选用的辅助成环剂混匀，用微量进样器移取到疏水性玻片表面，放入烘箱烘干，形成自组装环，再在显微镜下激发观察测定。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄承志，李原芳，范美坤，刘颖，
申请(专利权)人：西南师范大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]