本发明专利技术涉及小麦高分子量谷蛋白亚基的鉴定方法，特别是涉及通过酸性毛细管电泳（Ａ－ＣＥ）技术对小麦高分子量谷蛋白亚基进行鉴定的方法。小麦贮藏蛋白，特别是高分子量谷蛋白亚基的组成和含量对品质具有十分重要的作用。当前在小麦品质育种工作中的重点是对ＨＭＷ－ＧＳ组成的改良，特别是要提高优质高分子量谷蛋白亚基或亚基对的频率。目前常规育种方法与标记辅助选择技术相结合是小麦品质改良的主要手段，其中杂交早期世代优质蛋白亚基快速、微量、准确的鉴定是提高育种效率的关键。本发明专利技术的主要任务是解决针对小麦种子中贮藏的高分子量谷蛋白亚基的鉴定给出酸性毛细管电泳的缓冲液类型和添加成分、电泳条件参数和毛细管冲洗程序。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及小麦高分子量谷蛋白亚基的鉴定方法，特别是涉及通过酸性毛细管电泳(A-CE)技术对小麦高分子量谷蛋白亚基进行鉴定的方法。
技术介绍
小麦种子贮藏蛋白主要由醇溶蛋白和谷蛋白组成，它们在组成上具有高度的异质性和复杂性。醇溶蛋白分子量约在30000-80000道尔顿之间，在酸性凝胶电泳条件下，一个品种可分离出15-30个组分，根据其相对迁移率可分为α、β、γ和ω四种醇溶蛋白，它们分别占其总量的25％、30％、30％和15％。麦谷蛋白包括高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)两种，它们分别占胚乳总蛋白含量的10％和30％左右。大量研究证明，小麦贮藏蛋白，特别是高分子量谷蛋白亚基的组成和含量对品质具有十分重要的作用。面粉可以加工成各种面包、面条、饼干、糕点、馒头等多种专用食品，其特殊的制面特性主要是由贮藏蛋白的二硫键多聚体结构决定的，其中谷蛋白主要决定面团的弹性，而醇溶蛋白则决定面团的延展性。目前已清楚HMW-GS由第1部分同源群染色体上的Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位点编码。每个位点均有二个紧密连锁基因，分别控制分子量较大的x型亚基和分子量较小的y型亚基(用SDS-PAGE方法测得的分子量为90-150KD)。由于部分基因处于沉默和不表达状态，多数普通小麦品种在SDS-PAGE图谱上仅能检测到3-5个高分子量谷蛋白亚基，其中2个由Glu-D1控制，1个或2个由Glu-B1控制，1个或0个由Glu-A1控制。在各个位点上均存在广泛的等位基因变异，目前已在面包小麦中鉴定和命名了20多个HMW-GS等位基因。不同的亚基及其等位基因对小麦品质的作用各异，在已经检测到的高分子量谷蛋白亚基中，1Dx5+1Dy10(4)、1Bx17+1By18(3)、1Bx7+1By8(3)与1Bx13+1By16(3)、1Ax1(3)、1Ax2*(3)等亚基对或亚基与小麦优质品质有关(括号内为品质评分)，而1Dx2+1Dy12为劣质亚基对，亚基对1Dx4+1Dy12对品质有重要作用，其品质评分仅次于1Dx5+1Dy10。在我国推广品种中1Dx5+1Dy10、1Bx17+1By18等优质亚基对的频率很低，这可能是造成品质差的重要原因之一。当前在小麦品质育种工作中的重点是对HMW-GS组成的改良，特别是要提高优质高分子量谷蛋白亚基或亚基对的频率。近年来，尽管通过基因工程和分子标记辅助选择手段改良小麦品质已显示出很大的应用前景，但这些方法往往费用昂贵、分析成本高、费工费时，而且针对优质贮藏蛋白基因的基因工程和分子标记辅助选择方法离实际应用还有一定距离，目前还难以满足品质育种工作的要求。因此急需研发新的更为可靠的优质基因标记辅助选择技术。目前常规育种方法与标记辅助选择技术相结合是小麦品质改良的主要手段，其中杂交早期世代优质贮藏蛋白亚基快速、微量、准确的鉴定是提高育种效率的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用酸性毛细管电泳技术快速鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，主要任务是解决针对小麦种子中贮藏的高分子量谷蛋白亚基的鉴定给出酸性毛细管电泳的缓冲液的类型和添加成分、电泳条件参数和毛细管冲洗程序，该方法能在小麦杂交早期世代对小麦种子优质贮藏蛋白亚基作出快速、准确的鉴定与筛选。本专利技术的技术方案包括材料取样、样品制备、高效毛细管电泳和数据处理分析，其中材料取样、样品制备以及数据处理采用的是常规方法，其特征是高效毛细管电泳时的电泳缓冲液(buffer)为100-120mm磷酸-甘氨酸缓冲液，该缓冲液pH值为2.5-2.8，添加有18-22％乙腈和0.04-0.06％羟脯氨酰甲基纤维素(HPMC)，具体电泳条件参数为毛细管内径25或50μm毛细管长度24-28cm电压10.0-13.5KV温度37-40℃进样8-12KV，6-10sec在上述的技术方案中，为了能够连续检测样品和保证检测结果的准确性，在进行高效毛细管电泳时，对毛细管进行冲洗必须按冲洗程序操作，按照冲洗目的的不同，冲洗程序具体分为以下四种情况1、对于新的毛细管在使用前要进行预处理冲洗，冲洗程序如下H2O 4-6min0.1MNaOH 9-12minH2O 4-6min1MH3PO48-12minBuffer 50-75min2、进样前对毛细管进行冲洗，冲洗程序如下 H2O 1.5-2.5min0.1MNaOH 4-6minH2O 4-6min1MH3PO44-6minBuffer 16-24min3、当一次鉴定测定多个样品时，两次样品检测之间要进行冲洗，冲洗程序如下1MH3PO41.5-3minBuffer 1.5-2.5min4、检测结束后对毛细管进行冲洗，冲洗程序如下1MH3PO44-6minH2O 4-6min0.1MNaOH 1.5-2.5minH2O 13-17minN29-11min通过本专利技术可以建立重要HMW-GS标准毛细管电泳图谱，进而形成对优质亚基进行鉴定的一套完整的技术体系。本专利技术的优点在于(1)样品用量少微量检测是开展杂交早期世代优质基因选择的关键。本技术只需单粒种子无胚端10-15mg胚乳面粉，并可进行5次以上重复分析。另外，所提取的蛋白质干样可长期保持而不影响分离效果。(2)分离时间短利用上述电泳参数，单个样品一般在12min分离完成，而常规SDS-PAGE方法一般需要1-2天时间。(3)亚基电泳模式分辨度高、易于应用在酸性缓冲液条件下，多数HMW-GS表现为一个主峰和1-3个副峰(如附图所示)。理论上A-CE技术每米理论塔板数远远高于高效液相色谱和SDS-PAGE方法。该技术可对目前所鉴定的优质HMW谷蛋白亚基进行快速分离和鉴定，包括一些SDS-PAGE和HPLC方法难以区分的亚基，如17+18，2和2*和近年来发现的一些迁移率很相似的新亚基，以及10和12，2和5等(RP-PLC不能有效分离)。通过与优质亚基标准图谱以及单样与混合样的比较分析，能准确鉴定5+10与2+12以及14+15、13+16、17+18、7+8、1、2*等亚基。(4)重复性好利用上述冲洗方法可以获得较好的重复性分离。重复间峰迁移时间和峰高的相对标准偏差(RSD)分别小于1％和3％，无峰拖尾现象。(5)分离自动化程度高毛细管电泳从进样到结果分析自动化程度高，简便易于操作，这是传统SDS-PAGE方法所无法比拟的。(6)分析成本低除了毛细管电泳仪器较贵以外，分析成本低，一般只需一些常用试剂，所有试剂均用量很少，而且不需使用丙稀酰胺等有毒药品。因此，与传统方法相比，A-CE技术的分析成本较低。此外，该鉴定方法对小麦流通与加工以及品种权益保护等领域也具有重要的应用价值。附图说明图1小麦品种Hope(1，6+8，5+10)高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)的酸性毛细管电泳(A-CE)连续20次分离重复性比较图谱。图中显示第1、5、10、15和20次分离的电泳图谱。图2小麦品种中国春、Hope和硬粒小麦品种Simeto高分子量谷蛋白亚基的酸性毛细管电泳分离图谱。A中国春(N，7+8，2+12)B Hope(1，6+8，5+10)C Simeto(N，7+8)图3密穗小麦(Triticum compac本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种小麦高分子量谷蛋白亚基的酸性毛细管电泳鉴定方法，包括材料取样、样品制备、高效毛细管电泳和数据处理分析，其中材料取样、样品制备以及数据处理采用的是常规方法，其特征是高效毛细管电泳时的电泳缓冲液为１００－１２０ｍｍ磷酸－甘氨酸缓冲液，该缓冲液ｐＨ为２．５－２．８，添加有１８－２２％乙腈和０．０４－０．０６％羟脯氨酰甲基纤维素，具体电泳条件参数为：毛细管的内径为２５或５０μｍ，长度为２４－２８ｃｍ电压：１０．０－１３．５ＫＶ温度：３７－４０℃进样 ：８－１２ＫＶ，６－１０ｓｅｃ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：晏月明，余建中，姜怡，安学丽，胡英考，
申请(专利权)人：首都师范大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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