本发明专利技术公开了一种体外红细胞的血型血清学实验检定方法，该方法包括如下步骤：１）将木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液与红细胞悬液混合均匀，在水浴场、微波场、或自动温控振荡仪中孵育；所述木瓜凝乳蛋白酶制剂含有木瓜凝乳蛋白酶，Ｌ－半胱氨酸和普鲁兰；２）加入酶抑制剂－６４试剂溶液，分别加入受检物，阳性对照物和阴性对照物，混合均匀，在水浴箱、微波场或自动温控振荡仪中孵育；所述酶抑制剂－６４含有反式－环氧琥珀酰－Ｌ－亮氨酰氨基（４－胍基）丁烷、甘露醇、海藻糖和普鲁兰；３）１２０×ｇ离心１分钟，记录检测结果。本发明专利技术所提供的检测方法，具有较强的特异性，较高的实验安全性与实验检定灵敏度，可用于血型抗体与相应红细胞血型抗原的检定，如抗体筛检，抗体特异性鉴定，抗体效价滴定，输血相容性试验等。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及体外血型血清学检定方法，特别是提供一种以木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液、酶抑制剂-64试剂溶液为介质的体外血型血清学实验检定方法。
技术介绍
在常规体外血型血清学—蛋白酶实验检定方法中，由于使用的巯基蛋白酶试剂缺乏完整的质量检定标准，以及传统的木瓜酶、菠萝酶一步法、二步法实验技术，存在对红细胞的过度水解、对血型抗体的水解—降解作用，是造成蛋白酶检定实验出现“假阳性”、“假阴性”实验检定结果的本质性原因。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种准确的体外血型血清学检定方法。本专利技术所提供的检测体外血型血清学的方法，包括如下步骤1)将木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液与红细胞悬液混合均匀，在水浴场、微波场、或自动温控振荡仪中孵育；所述木瓜凝乳蛋白酶制剂含有木瓜凝乳蛋白酶，L-半胱氨酸和普鲁兰；2)加入酶抑制剂-64试剂溶液，分别加入受检物，阳性对照物和阴性对照物，混合均匀，在水浴箱、微波场或自动温控振荡仪中孵育；所述酶抑制剂-64含有反式-环氧琥珀酰-L-亮氨酰氨基(4-胍基)丁烷、甘露醇、海藻糖和普鲁兰；3)120×g离心1分钟，记录检测结果。为了使检测的效果更好，所述木瓜凝乳蛋白酶制剂中还含有甘露醇、海藻糖和维生素C盐；所述木瓜凝乳蛋白酶制剂中每200000PU单位的木瓜凝乳蛋白酶中甘露醇、海藻糖和维生素C盐的含量分别为0.2-0.3mol、0.01-0.02mol和0.01-0.02mol；所述酶抑制剂-64中每40000TU单位的反式-环氧琥珀酰-L-亮氨酰氨基(4-胍基)丁烷中甘露醇、海藻糖和普鲁兰的含量分别为0.2-0.3mol、0.01-0.02mol和0.05-0.1mol。木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液具有的活力效价为1/10分钟10-16PU/50μl、或者是10分钟100-160PU/50μl；酶抑制剂-64试剂溶液具有的活性效价为1/10分钟20-32TU/50μl、或者是10分钟200-320TU/50μ1。所述的水浴孵育为在37-39℃水浴孵育5-10分钟；所述的微波孵育为在设定功率300-360W、输出功率30％的微波场中孵育200-300秒钟；所述的自动温控振荡仪孵育为在37-39℃、300-500r/min、1-3Level自动温控振荡仪孵育5-10分种。通过热效应，完成木瓜凝乳蛋白酶对红细胞膜的水解修饰作用，形成血型抗原对血型抗体的吸附—凝集条件。检定实验使用的红细胞试剂是ABO以外血型抗体筛检红细胞悬液，红细胞ABO以外血型谱细胞悬液，A型红细胞悬液，B型红细胞悬液，受血者红细胞悬液，供血者红细胞悬液，患者红细胞悬液。上述红细胞试剂的红细胞浓度为2-4％。检定实验使用的标本物是患者(或受血者)血清样本，供血者血清样本，患者、供血者IgG抗-A、抗-B实验检定用血清样本溶液，红细胞放散液；以及人源型ABO-IgG-抗-A、抗-B，Rh-抗-D、抗-C、抗-E、抗-c、抗-e、Kell-抗-K、抗-k、kiad-抗-JKa、抗-JKb、Lewis-抗-Lea、抗-Leb、抗-Lea+b、P-抗-P1抗体血清。在检定实验中，如采用U型多孔板为实验容器，可以采用扫描酶标仪—血型判读系统自动读取、记录实验结果；用试管为实验容器，采用人工读取、记录实验结果。本专利技术所提供的实验检定方法，用于人类血样本的ABO-IgG-抗-A、抗-B，Rh-抗-D、抗-C、抗-E、抗-c、抗-e、Kell-抗-K、抗-k、kiad-抗-JKa、抗-JKb、Lewis-抗-Lea、抗-Leb、抗-Lea+b、P-抗-P1等血型抗体与相应红细胞血型抗原的检定，如临床血样本的抗体筛检，抗体特异性鉴定，抗体效价滴定，IgG抗A、抗-B检定，输血相容性试验等。本专利技术克服了传统的蛋白酶实验检定的技术缺限，提高了实验检定的安全性与灵敏度，具体表现在1、使用专用型活力效价为10-16PU/50μl或100-160PU/50μl的木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液，在规定的实验温度-时间条件下，对红细胞膜进行有效的水解修饰，裸露血型抗原受体，使之具备与相应的血型抗体直接形成可视性免疫凝集的能力。2、在木瓜凝乳蛋白酶完成对红细胞膜的水解修饰作用后，使用专用型活性效价为20-32TU/50μl或200-320TU/50μl的酶抑制剂-64试剂溶液，快速抑制木瓜凝乳蛋白酶活力。防止活性酶对红细胞的过度性水解效应—产生“假阳性”实验结果，以及活性酶对血型抗体的水解效应—产生“假阴性”实验结果。显著提高检定实验的安全性与灵敏度，从根本上消除蛋白酶试剂在体外血型血清学中“试剂型”实验检定事故的发生。3、所使用的木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液、酶抑制剂-64试剂溶液，不含有蛋白质沉淀剂，红细胞凝集素。杜绝“试剂性——假阳性”检定实验结果的产生。4、微波是一种超短波，在微波的热效应、化学效应、生物学效应的作用下，木瓜凝乳蛋白酶对红细胞水解修饰速率加快，酶抑制剂-64与生物巯基形成复合物的速率加快，是显著降低实验耗时，保持实验检定安全性与灵敏度的重要实验方法。5、本专利技术的核心技术是利用木瓜凝乳蛋白酶对红细胞进行有效地水解修饰，酶抑制剂-64使完成对红细胞水解修饰作用后的木瓜凝乳蛋白酶快速失去活力效价，可近一步拓展为对红细胞试剂的酶化预处理，制备3％酶化A型、B型红细胞试剂，3％酶化ABO以外血型抗体筛检红细胞悬液，以适应血液中心批量化开展非盐水介质血型抗体的筛检、鉴定实验。具体实施例方式实验材料1、细胞材料3％受检红细胞悬液，3％受血者红细胞悬液，3％供血者红细胞悬液，3％Rho(D)阳性红细胞悬液，3％Rho(D)阴性红细胞悬液，3％A型红细胞悬液，3％B型红细胞悬液，3％筛检红细胞悬液，3％血型谱细胞悬液。上述细胞材料中3％受检红细胞悬液，3％受血者红细胞悬液，3％供血者红细胞悬液取自医院血库血样本。其它细胞试剂产自Immucor。2、血清材料患者、供血者血清标本，红细胞放散液，患者、供血者IgG抗-A、抗-B实验检定用血清样本溶液；人源型ABO-IgG-抗-A、抗-B，Rh-抗-D、抗-C、抗-E、抗-c、抗-e、Kell-抗-K、抗-k、kiad-抗-JKa、抗-JKb、Lewis-抗-Lea、抗-Leb、抗-Lea+b、P-抗-P1等抗体血清标本，以及AB血清标本。上述血清材料中患者血清样本，供血者血清样本，患者、受血者IgG抗-A、抗-B实验检定用血清样本溶液，红细胞放散液等，取自医院血库血样本。其它血清材料产自Immucor。实施例1、木瓜凝乳蛋白酶的提取与制备取1000g的番木瓜果浆冰冻物，用微波加热融化，加入1000ml 0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5)，在匀浆器中匀浆。加入1％壳聚糖溶液100ml，匀浆搅拌，室温静置2小时后过滤，去除沉淀，保留滤液。向滤液中加入硫酸铵至35％饱和度，室温静置60分钟，在2-8℃、10000×g离心20分钟，去除沉淀；向离心上清液中加入硫酸铵至50％饱和度，室温静置60分钟，在2-8℃、10000×g离心20分钟，去除沉淀；在上清液中加入过量酒石酸溶液，调节pH至＜2.5，室温静置60分钟。10000×g离心20分钟，弃去沉淀物；最后再向上清液中加入硫酸铵至70％饱和度，室温静置60分钟，10000本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测体外血型血清学的方法，包括如下步骤： １）将木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液与红细胞悬液混合均匀，在水浴场、微波场、或自动温控振荡仪中孵育；所述木瓜凝乳蛋白酶制剂含有木瓜凝乳蛋白酶，Ｌ－半胱氨酸和普鲁兰； ２）加入酶抑制剂－６４试剂溶液，然后分别加入受检物，阳性对照物和阴性对照物，混合均匀，在水浴箱、微波场或自动温控振荡仪中孵育；所述酶抑制剂－６４含有反式－环氧琥珀酰－Ｌ－亮氨酰氨基（４－胍基）丁烷、甘露醇、海藻糖和普鲁兰； ３）１２０×ｇ离心１分钟，记录检测结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：卢世昌，刘俊凤，
申请(专利权)人：广州伟仕科技有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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