检测疟原虫谷氨酸脱氢酶抗原的方法技术

以免疫层析技术检测血液样品中的恶性疟原虫或间日疟原虫抗原的方法，特征在于其中所使用的抗体是抗疟原虫谷氨酸脱氢酶（ＧＤＨ）抗体。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
专利技术的所属领域本专利技术涉及检测疟原虫抗原的方法，特别是涉及使用自测式免疫层析法(ICT)检测体液样品中的疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)抗原，并借以诊断恶性疟或间日疟的方法，以及用于该方法的检测条。专利技术的背景疟疾是广泛流行于热带、亚热带及温带边缘地区的一种重要虫媒传染病。在所有虫媒传染性疾病中，疟疾是发病率和死亡率最高的疾病之一。目前世界上仍有90多个国家、24亿人生活在疟疾流行区。每年有5亿人发病，250多万人死亡。发病和死亡的病例中，90％是在非洲和亚洲的贫穷国家。据不完全统计，目前中国全国估计每年有25-30万人发病。另外，疟疾还是造成进入疟区部队非战斗减员的主要疾病之一。面对疟疾对人类造成的严重威胁，世界卫生组织(WHO)提出进一步研究与开发更有效的疟疾防治药物和诊断技术，以达到2010年全球疟疾死亡人数减少50％，2015年再减少50％的目标。由于受各种因素的影响，疟疾疫苗的研制进展缓慢，因此实现疟疾的快速有效的诊断和治疗就显得尤为重要。八十年代以来，随着分子生物学的发展和基因诊断技术的出现，疟疾诊断方法也在不断改进，显示了较高的敏感性和特异性，且实现了疟疾的早期快速诊断。然而，这些方法都需要使用复杂的仪器设备和技术条件，所以难以在基层推广应用。以检测疟原虫特异性抗原为基础的免疫学方法具有快速、简便、可靠等优点，在疟疾诊断上日益受到重视。目前常用的检测方法中，所使用的靶抗原主要是相对特异的疟原虫富组氨酸蛋白II(HRPII)和乳酸脱氢酶(LDH)。但基于靶抗原HRPII的诊断方法(Parasight-F及ICT)存在某些缺点，这些缺点包括由于HRPII只存在于无性期和早期配子体中，故不能检测仅含有成熟配子体的血液样品；临床症状已消失、血液中虫体已被清除之后，HRPII仍会存在很长一段时间；由于抗HRPII单克隆抗体可能与类风湿因子产生交叉反应，因而可能导致假阳性。相对地，基于以LDH为靶抗原的诊断方法则较好地解决了这些问题。与传统的镜检法相比，其敏感性在86％至93％之间，特异性在92％至97％之间，其准确性高于已知以疟原虫HRP II为诊断靶抗原的Parasight-F和ICT方法。专利技术目的本专利技术的一个目的是提供一种以免疫层析技术检测血液样品中的恶性疟原虫或间日疟原虫抗原的方法，特征在于其中所使用的抗体是抗疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)抗体。根据本专利技术方法的一个优选实施方案，特征在于所说的抗体是抗恶性疟原虫GDH抗体。根据本专利技术方法的另一个优选实施方案，特征在于所说的抗体是抗恶性疟原虫GDH和间日疟原虫GDH的交叉反应性抗体(以下简称为交叉反应性抗体)。根据本专利技术方法的优选实施方案，特征在于所说的抗体是单克隆抗体。本专利技术的另一个目的是提供用于本专利技术的检测方法的抗体。根据本专利技术抗体的一个优选实施方案，特征在于所说的抗体仅与恶性疟原虫GDH结合的抗体。根据本专利技术抗体的另一个优选实施方案，所说的抗体是可与恶性疟原虫和间日疟原虫结合的交叉反应性抗体。根据本专利技术抗体的再一个优选实施方案，所说的交叉反应性抗体是用胶体金或乳胶颗粒标记的。根据本专利技术的再一个优选实施方案，其中所说的胶体金颗粒的粒度为20-30nm。根据本专利技术的再一个优选实施方案，其中所说的血液样品可以是血浆、全血或血清。根据本专利技术抗体的再一个优选实施方案，所说的交叉反应性抗体可与恶性疟原虫GDH的不同抗原决定基结合。本专利技术的再一个目的是提供用于检测血液样品中恶性疟原虫或间日疟原虫的检测条，其中包括试剂载体条、抗恶性疟原虫GDH抗体、抗恶性疟原虫GDH和间日疟原虫GDH交叉反应性抗体，以及羊或兔抗小鼠IgG抗体的第二抗体。附图简要说明附图说明图1显示恶性疟原虫基因组PCR扩增结果。其中泳道M是分子量标志；泳1，2是PCR产物；泳道3是阴性对照图2显示pGEX-GDH重组质粒的酶切鉴定。其中泳道1-5是pGEX-GDH的EcoRI+Sal I酶切片段；泳道6是pGEX-4T-1的EcoR I+Sal I酶切片段；泳道7是PCR产物；泳道M是分子量标志。图3显示重组蛋白的SDS-PAGE分析。其中泳道M是蛋白质分子量标准；泳道1是pGEX-4T-1/BL21；泳道2是pGEX-GDH/BL21；泳道3是pGEX-GDH/BL21超声处理后的上清；泳道4是pGEX-GDH/BL21超声处理后的沉淀；泳道5是经3mol/L尿素洗后的包涵体；泳道6是纯化的重组蛋白质。图4显示重组蛋白的Western-blot分析。其中泳道M是蛋白质分子量标准；泳道1是pGEX-GDH/BL21；泳道2是pGEX-4T-1/BL21。图5显示多克隆抗体的Western-blot分析。其中泳道M是蛋白质分子量标准；泳道1是间日疟原虫；泳道2是恶性疟原虫；泳道3是正常人红细胞。图6显示用于本专利技术检测方法的检测试剂载体条上的试剂分布模式图。专利技术的详细描述以免疫学为基础的血清学检测，由于其具有操作简便快速和结果易于判定等优点，所以已成为疟疾诊断的主要方法。免疫学检测主要是利用单克隆抗体检测疟原虫的特异性抗原(即所谓抗原捕获法)。目前报道的被检抗原主要是HRPII和LDH。根据疟疾流行区偏僻、落后的特点，迄今已开发了多种适合疟疾流行区现场使用的免疫层析检测方法和相应的试剂条，例如检测恶性疟原虫的商品检测条ParaSight-F(dipstick)和ICT Malaria P.f(ICT1)，以及同时检测恶性疟原虫和非恶性疟原虫的商品检测条OptiMAL和ICT Malaria P.f/P.v(ICT2)等。这些检测方法和检测条基本上都是基于疟原虫HRP II或LDH抗原的。其原理为利用硝酸纤维素膜(NC)制备免疫层析测试条，在NC上包被抗被检抗原的一株单克隆抗体作为捕获带，同时，将另一株单克隆抗体偶联在胶体金或乳胶上作为检测试剂。当样品溶液和检测试剂通过捕获带时，二者形成的复合物即被包被在膜上的抗体捕捉，如果样品中含有被检抗原，则捕获带可发生颜色反应，并且颜色反应的强弱与样本中的抗原浓度成正比。虽然这些方法和检测条同样具有使用上简便快捷，不需特殊仪器和适于基层医院或防疫部门大面积普查使用等优点，但它们的特异性和敏感性仍受到一定的限制。为了进一步寻找具有更高特异性和敏感性的靶抗原，近年来人们也已对疟原虫的另一种重要代谢酶一谷氨酸脱氢酶(GDH)引起了的关注。GDH是一种普遍存在于生物体内对碳、氮代谢起重要作用的酶，在疟疾的整个红内期均能表达。该酶催化谷氨酸脱氨基生成α-酮戊二酸，并使辅酶I和II由氧化型(NAD+、NADP+)转化为还原型(NADH、NADPH)。以前的研究已揭示，疟原虫GDH与脊椎动物组织的GDH在理化性质、酶学特性及生物学活性上均有较大差异，如疟原虫GDH活性不受嘌呤核苷酸(GTP、ADP)的影响，而脊椎动物组织的GDH可被GTP、ADP激活或抑制；疟原虫GDH以辅酶II为其辅酶，而脊椎动物组织的GDH可以辅酶I或II作为辅酶。临床和实验研究证据表明，疟原虫比其宿主细胞更易受氧化压力影响。因此，参与巯基代谢及参与还原型辅酶II(NADPH)再生的脱氢酶对于疟原虫免受宿主体内氧化剂损伤及维持生存起着极其重要的作用。疟原虫GDH被认为是NADPH生成的主要本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李明，吴英松，李妍，李林海，宁云山，
申请(专利权)人：热带病研究所，
类型：发明
国别省市：