乳腺癌早期筛查的分子标志物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于乳腺癌早期筛查的分子标志物，所述的分子标志物是磷酸化的抗原片段，其序列如SEQ ID NO.1所示，并且该抗原中的丝氨酸残基为磷酸化的残基。所述的乳腺癌包括Luminal A、Luminal B、HER2阳性和三阴性乳腺癌。本发明专利技术还涉及能够识别所述分子标志物的检测试剂及包含所述的检测试剂的检测试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
乳腺癌早期筛查的分子标志物及其应用
本专利技术属于医药生物
，具体的，涉及一种乳腺癌早期筛查的分子标志物及其应用。
技术介绍
基因组不稳定是肿瘤细胞重要的标志，引起基因组不稳定的原因是细胞周期调控、DNA复制以及DNA损伤修复分子通路中的相关蛋白发生突变或者错误表达导致其功能异常所致。P53结合蛋白1(53BP1)是Iwabuchi等在1994年通过酵母双杂交系统筛选出来的与P53相互结合的蛋白，其基因定位在染色体15号染色体长臂，全长6.6kb，编码1972个氨基酸，蛋白分子量为217kDa。53BP1作为在修复DNA双链损伤(DSB)途径中发挥重要作用的蛋白分子，能在DSB发生后第一时间被蛋白激酶ATM磷酸化且聚集在DNA损伤处，是公认的DNA双链损伤的标志分子之一。ATM磷酸化53BP1聚集在DNA损伤位点，阻止DNA双链损伤的正常修复，最终引起细胞基因组不稳定，导致肿瘤发生。乳腺癌是一种常发生于乳腺上皮组织的最常见的妇科恶性肿瘤，影响着全世界女性的身心健康以及生活质量和生命安全。按照乳腺癌细胞表面雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、表皮生长因子2受体(HER-2)等表达的不同，可将乳腺癌分为LuminalA、LuminalB、HER2阳性和三阴性等类型。LuminalA型乳腺癌的特点表现为：ER+、和/或PR+、HER2-，是最为常见的激素受体呈阳性的乳腺癌，占所有侵润性癌的30％-40％。LuminalB型乳腺癌的特点表现为：ER+、和/或PR+、HER2+。该亚型乳腺癌患者，绝经前者所占比例较低。HER2过表达型乳腺癌的特点表现为：ER-、PR-、HER2+。该亚型乳腺癌较其他亚型乳腺癌所占比例较少，仅为6.7％。三阴性乳腺癌(Triple-NegativeBreastCancer，TNBC)的特点表现为：ER-、PR-、HER2-，该亚型乳腺癌所占比例为20％。乳腺癌种类多，危害极大，但目前仍缺少特异性早期分子诊断的方法。我们检测乳腺癌组织中53BP1蛋白的磷酸化水平，结果显示磷酸化53BP1可作为诊断乳腺癌的分子标志物。以磷酸化53BP1为靶点的乳腺癌分子诊断试剂盒可以应用于乳腺癌的筛查和诊断，因而有着重要的临床应用价值和广阔的市场前景。
技术实现思路
本专利技术首先涉及一种用于乳腺癌早期筛查的分子标志物，所述的分子标志物是磷酸化的抗原片段，其序列如SEQIDNO.1所示，并且该抗原中的丝氨酸残基为磷酸化的残基。所述的乳腺癌包括LuminalA、LuminalB、HER2阳性和三阴性乳腺癌。SEQIDNO.1：CIED(pS)QPE(pS)QVLEDD，其中的(pS)为磷酸化的丝氨酸；本专利技术还涉及能够识别所述分子标志物的检测试剂，所述的检测试剂包括，(1)特异性结合所述分子标志物的抗体，所述的抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、功能性抗体片段、抗体Fab区，纳米抗体、嵌合抗体、多特异性抗体；(2)特异性结合所述分子标志物的配体蛋白或多肽；(3)特异性识别所述分子标志物的非蛋白类化合物；本专利技术还涉及一种制备检测所述分子标志物的多克隆抗体的制备方法，所述的方法包括如下步骤：(1)将所述的磷酸化的抗原片段偶联至载体蛋白上；(2)将抗原与佐剂1：1混匀后，免疫新西兰兔。具体方法如下：第一次免疫将200μg抗原多肽与1ml弗氏完全佐剂(Sigma公司产品)混匀，背部皮下注射于西新兰大白兔(注射前，在兔的耳缘静脉取1.5ml血作为免疫前血清)。一周后第二次免疫开始，抗原多肽降至100μg，佐剂转换为弗氏不完全佐剂(Sigma公司产品)，两周后耳缘静脉取血验证抗体效价。再过一周后开始下一次免疫，以此类推直至得到高效价的抗体血清。(3)验证抗体效价具体方法为：将收集的抗血清与体外培养的约10000个MFC-7肿瘤细胞株的总蛋白提取物进行蛋白印迹杂交，能够清晰的标记出细胞内磷酸化53BP1蛋白时，即为效价合格。验证抗体滴度达标的方法为：1：2000稀释抗血清进行蛋白印迹杂交，可以清晰检测到10000个细胞内磷酸化53BP1蛋白。本专利技术还涉及一种用于乳腺癌早期筛查的检测试剂盒，所述的试剂盒包含能够识别所述分子标志物的检测试剂，优选的，所述的检测试剂为多克隆抗体。所述的乳腺癌包括LuminalA、LuminalB、HER2阳性和三阴性乳腺癌。本专利技术的有益效果在于，本专利技术制备的乳腺癌早期分子诊断试剂盒是基于免疫组化染色方法建立起来的检测体系，不仅敏感性高，特异性强，而且方便、经济、快捷，容易被患者所接受，便于临床检查和健康普查时使用。它的优点是能够达到早期诊断、准确度高、误诊率低等。其创新点是以最新发现的乳腺癌早期发生标志分子为靶点的全新分子诊断试剂盒，技术达到或超过国际先进水平，为填补国内外市场空白项目。项目核心目标是在自身和相关领域科研成果基础上，进行技术改进创新和科研成果的转化应用，研发出一套全新的早期乳腺癌分子诊断方法。此检测系统的建立还能促进各级医疗机构临床诊断部门的发展和诊断水平的提高以及其他肿瘤标志物特检项目的开展，并能最终满足人民群众最迫切的健康需求，因此具有重大的经济效益和社会效益。附图说明图1、228例样本(前8例为非乳腺癌组织，详见附表1，对应样本编号为表1中最左栏)的染色后镜检结果。图2、所有乳腺癌组织样本中磷酸化53BP1的抗原表达量统计结果图。图3、不同TNM分期乳腺癌组织样本中磷酸化53BP1抗原的表达量统计结果图。图4、不同病理分级的乳腺癌组织样本中磷酸化53BP1抗原的表达量统计结果图。图5、不同类型乳腺癌组织样本中磷酸化53BP1抗原的表达量统计结果图。具体实施方式实施例1、针对磷酸化53BP1蛋白的抗体的制备和生产1、通过免疫动物的方法，制备针对磷酸化53BP1蛋白的抗体：首先进行根据53BP1磷酸化位点设计制备抗体所需的多肽；根据磷酸化53BP1蛋白分子中蛋白激酶ATM(ataxia-telangiectasiamutatedgene)磷酸化位点(第25位和第29位丝氨酸)设计制备磷酸化53BP1抗原多肽CIED(pS)QPE(pS)QVLEDD，其中的(pS)为带有磷酸根的丝氨酸，由杭州丹港生物公司合成。将磷酸化53BP1抗原多肽偶联到载体蛋白KLH(血蓝蛋白)上。然后抗原溶液与抗体佐剂(弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂，Sigma公司产品)体积比1:1混匀，皮下注射入新西兰大白兔背部(第一次免疫将200μg抗原多肽与1ml弗氏完全佐剂混匀，背部皮下注射于西新兰大白兔。一周后第二次免疫开始，抗原多肽降至100μg，佐剂转换为弗氏不完全佐剂(Sigma公司产品)，两周后耳缘静脉取血验证抗体效价。再过一周后开始下一次免疫，以此类推直至得到高效价的抗体血清)。在第一次注射抗原多肽前，耳缘静脉取血作为免疫前血清。每次注射抗原多肽后一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于乳腺癌早期筛查的分子标志物，所述的分子标志物是磷酸化的抗原片段，其序列如SEQ ID NO.1所示，并且该抗原中的丝氨酸残基为磷酸化的残基；所述的乳腺癌包括Luminal A、Luminal B、HER2阳性和三阴性乳腺癌。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于乳腺癌早期筛查的分子标志物，所述的分子标志物是磷酸化的抗原片段，其序列如SEQIDNO.1所示，并且该抗原中的丝氨酸残基为磷酸化的残基；所述的乳腺癌包括LuminalA、LuminalB、HER2阳性和三阴性乳腺癌。


2.能够识别权利要求1所述分子标志物的检测试剂，所述的检测试剂包括，
(1)特异性结合所述分子标志物的抗体，所述的抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、功能性抗体片段、抗体Fab区，纳米抗体、嵌合抗体、多特异性抗体；
(2)特异性结合所述分子标志物的配体蛋白或多肽；
(3)特异性识别所述分子标志物的非蛋白类化合物。


3.一种制备检测权利要求1所述分子标志物的多克隆抗体的制备方法，所述的方法包括如下步骤：
(1)将所述的磷酸化的抗原片段偶联至载体蛋白上；
(2)将抗原与佐剂混匀，皮下注射入新西兰大白兔背部免疫步骤为：
1)第一次免疫将200μg抗原多肽与1ml弗氏完全佐剂混匀，背部...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱长军，袁增强，张杰，廖亚金，
申请(专利权)人：南京凯弗生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32