P27蛋白的表达及其应用制造技术

具有序列１所示核苷酸序列的ＤＮＡ序列。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及禽白血病病毒P27蛋白的表达以及所述蛋白的应用。
技术介绍
禽白血病(Avian Leukosis)是由禽白血病病毒和禽肉瘤病病毒群中的病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称。禽白血病是禽类的常见病，目前没有疫苗，也没有有效的抗病毒药，常通过净化措施，培育无白血病鸡群。禽白血病病毒可以垂直或水平传播，给养鸡业生产造成很大危害，国内兽医、人医生物制品厂生产的数种禽胚源疫苗和禽胚源细胞苗，均以鸡胚为原材料，若不通过禽白血病抗原的检测，引起病毒的扩散与再感染，其危害可想而之。并且涉及到人类的公共卫生问题。目前用琼脂扩散方法，检测抗原，也有用补体结合试验方法、萤光法、酶联法，这些方法仅限于在实验室研究，在敏感性、特异性、稳定性等方面均有一些问题，停留在研究阶段，所以不能应用于生产中检测，目前尚缺乏有效的检测手段。P27基因是禽白血病病毒不同亚群之间的一段高度保守的基因。p27蛋白是病毒核心外壳的主要成分，有许多易于检测的病毒抗原，是制备群特异性抗体的首选抗原。已经克隆了p27和gag基因(祝晓春陈福勇常建宇《中国兽医杂志》2001年(第37卷)第8期，8-10页)。禽白血病病毒的繁殖是一项相当繁琐的工作，目前尚无专一适用的细胞系用于该病毒的繁殖。制备方法无论是用细胞繁殖还是接种鸡体制备血浆毒都存在着成本高、产量低、耗时、操作繁杂、纯度不高等问题。本专利技术人经过多年研究成功地对p27蛋白进行了原核表达，相对于已有的真核表达而言，本专利技术表达外源基因成本低、产量高、安全、易纯化、纯度高而且简便易行。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的之一是提供P27蛋白的表达。具体而言，本专利技术人在已克隆的p27基因的基础上，根据已发表的AMV BAI-A株的基因序列设计了一对特异性引物，以重组质粒pGEM-gag为模板，采用PCR法对p27基因进行亚克隆，构建重组质粒pGEM-p27。对重组质粒PGEM-p27和表达载体pET-28α进行双酶切，回收酶切产物，连接构建重组表达质粒。将构建成功的重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选含重组质粒的基因工程菌。重组工程菌经IPTG诱导得到高效表达，其细胞裂解物用SDS-PAGE及Western blotting进行检测。用Ni-NTA亲和层析法纯化表达蛋白，经SDS-PAGE方法及Westernblotingt检测，分析纯化，获得了高纯度的p27蛋白。所述蛋白的纯度大于97％，蛋白浓度约为0.53mg/ml。高纯度p27蛋白的获得，为p27单抗的制备，重组p27蛋白结构的探讨奠定了基础。本专利技术制备的P27蛋白的分子量约为30KD。制备的P27目的基因片段的大小约为800bp。本专利技术的另一目的是提供P27蛋白作为诊断抗原的应用，从而解决了禽白血病抗原繁殖的难题。本专利技术的目的是用纯化的表达蛋白免疫家兔，获得高效价的抗p27单特异性多克隆抗体，从而可用作各种诊断抗体。本专利技术还提供了含有本专利技术表达蛋白的诊断试剂盒。可用于检测正常健康的原种、曾祖代、祖代、新培育的新品种、国家各地方的地方品种鸡群，是否在体内血液、器官、粪便及鸡蛋中携带鸡白血病病毒。检测国内兽医、人医生物制品企业生产的各种来源于鸡源为原材料生产的活疫苗，是否携带外原鸡白血病病毒。检测市场上流通的各种进口禽用疫苗，是否携带鸡白血病病毒。检测国内无特定病原微生物(SPF)鸡场生产的产品，是否携带外原性鸡白血病病毒。以及应用于科学研究等。附图说明图1是重组表达质粒(pET28α-p27)的PCR鉴定结果。其中1未加模板的对照；2初步鉴定为阳性克隆的PCR扩增结果；3λDNA/EcoRI+HindIII(21226bp，5148bp，2027bp，1584bp，1375bp，947bp，831bp，564bp)图2是重组表达质粒(pET28α-p27)的双酶切鉴定结果。1重组表达质粒的双酶切鉴定；2λDNA/EcoRI+HindIII(21226bp，5148bp，4268bp，2027bp，1584bp，1375bp，947bp，831bp，564bp)。图3表明表达产物经15％SDS-PAGE电泳表明表达的融合蛋白的分子量与预期的结果相符。经Alphar Imager进行光密度扫描分析，目的蛋白的表达量占总菌体蛋白约25.3％。1阴性对照含有空载体pET28α(+)的BL21(DE3)的表达产物；2低分子量标准蛋白Maker(97.4KD，66.2KD，43KD，31KD，20.1KD，14.4KD)；3诱导3小时的表达产物；4诱导3小时的表达产物；5诱导4小时的表达产物；6诱导5小时的表达产物图4是表达菌超声裂解后的SDS-PAGE分析图。重组工程菌诱导表达后，离心收集菌体，将菌体进行超声裂解，超声裂解后上清液中重组蛋白的含量为22.1％，沉淀中的含量为20.7％。1.超声裂解后的上清液；2.超声裂解后的沉淀；3.低分子量标准蛋白Maker；3.诱导表达产物；4.诱导表达产物。图5是纯化产物的SDS-PAGE分析图。裂解的菌体上清用镍鏊合剂亲和层析，在不同咪唑浓度的洗脱条件下，进行重组蛋白的纯化。SDS-PAGE电泳的结果显示，仅在分子量约30KDa处有一条清晰的目的蛋白带，而且只有在咪唑浓度为80mM和100mM的洗脱液中含高纯度的目的蛋白，其纯度大于97％，用紫外吸收法测得蛋白的浓度约为0.53mg/ml。其中1穿透液；2NTA-0洗脱液；3NTA-20洗脱物；4NTA-40洗脱物；5NTA-60洗脱物；6NTA-80洗脱物；7NTA-100洗脱物；8低分子量标准蛋白Maker；9NTA-200洗脱物；10NTA-1000洗脱物。图6是表达产物的Western印迹分析图。其中1低分子量标准蛋白Maker(97.4KD，66.2KD，43KD，31KD，20.1KD)；2经诱导表达后的菌体蛋白。图7是抗血清的Western印迹分析图。其中1Western印迹结果；2低分子量标准蛋白Maker(97.4KD，66.2KD，43KD，31KD，20.1KD)。图8为使用本专利技术p27蛋白的检测试剂盒的示意图。以下通过是实施例进一步说明本专利技术，实施例仅仅是说明性的，而不以任何方式限制权利要求的保护范围。实施例实施例1 P27蛋白制备工艺1重组工程菌的制备构建用于表达p27蛋白的重组工程菌，所用的表达载体是pET28α，宿主菌是大肠杆菌BL21(DE3)。(1)重组工程菌的构建过程①待插入的目的片断的制备a)重组质粒pGEM-Teasy/p27的双酶切以BmaHI和SalI对重组质粒pGEM-Teasy/p27进行双酶切，反应体系如下总反应体系为 50μlBmaHI2μlSalI 2μl10×T缓冲液 7.5μl底物DNA 20μl灭菌水 18.5μl以上各组分混匀，短暂离心后，于37℃温育6小时。b)酶切产物的回收琼脂糖凝胶电泳酶切产物。↓将凝胶取出置于Alpha Imager进行观察，并成像。↓紫外灯下切下含目的片段的凝胶，分别装入已称量过的离心管。↓按照DNA快速回收试剂盒的操作步骤，回收目的片断。②载体pET-28α(+)的双酶切对载体做与(1)相同的酶切处理。酶切结束后补水至100μl，用等体积本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈福勇，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：