中枢神经系统感染病原体检测试剂盒及其应用技术方案

本发明专利技术提供了一种中枢神经系统感染病原体检测试剂盒，包括反应液、逆转录引物、缓冲液1、缓冲液2、反应酶、内部质控、阳性质控以及稀释液。逆转录引物包括依次对应十八种病原体的第一至第十八逆转录引物组，序列如SEQ ID NO.1～36所示。缓冲液1中包含分别对应前12种病原体的第一至第十二扩增引物组以及第一至第十二探针；缓冲液2中包括依次对应后6种病原体的第十三至第十八扩增引物组以及第一探针、第三探针、第四探针、第六探针、第八探针和第九探针。第一至第十八扩增引物组序列如SEQ ID NO.37～72所示，第一至第十二探针序列如SEQ ID NO.73～84所示。本发明专利技术通过特异性设计引物和探针序列，成功实现了一次性对18种中枢神经系统感染病原体进行检测。

【技术实现步骤摘要】
中枢神经系统感染病原体检测试剂盒及其应用
本专利技术属于医学生物检测
，涉及可同时检测出18种中枢神经系统感染病原体的检测试剂盒，以及其在中枢神经系统感染病原体检测中的应用。
技术介绍
中枢神经系统感染是指各种生物性病原体(包括病毒、细菌、立克次体、螺旋体、寄生虫等)侵犯中枢神经系统实质、被膜及血管引起的急性或慢性炎症性疾病，如引发脑炎、脊髓炎、脑脊髓炎、脑膜炎、脑脊膜炎等。临床上，中枢神经系统感染病人常常发生昏迷、抽搐、瘫痪、感觉异常、吞咽困难和大小便障碍等症状。昏迷、瘫痪病人不会咳嗽、翻身，又容易并发肺炎和压疮；突发抽搐可导致窒息，小便障碍易并发泌尿道感染，并发症的发生延长病程和加重病情，导致患者的护理和治疗工作繁重。精准检测感染病原体对于对症治疗中枢神经感染疾病意义重大。传统的切片镜检病原微生物检测方法不适用中枢神经系统感染病原体检测，阳性率极其低，不超过10％。当前多采用分子检测手段进行，常用的分子检测手段有普通PCR、巢式PCR和荧光定量PCR。单重PCR是最早建立的PCR方法，只针对单个DNA模板进行扩增，实际应用中检测量巨大；多重PCR目前仅能同时检测少数几种中枢神经感染病原体，现有记载资料中一次性最多检测12种病原体，如专利号为CN108085408A的中国专利技术专利公开了一种能够快速检测细菌性中枢神经系统感染病原的引物和探针，实现一次性检测12种中枢神经细菌病原体，包括结核分枝杆菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、化脓杆菌、脑膜奈瑟氏菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌。然而，上述检测方法不涉及任何病毒病原体的检测，而由于免疫抑制剂的应用、化学治疗、放射治疗以及器官移植的开展，病毒性中枢神经系统感染率一直处于上升状态。上述专利检测方法的应用范围局限性很大。新型检测方法如二代测序技术(nextgenerationsequencing,NGS)，也被用于中枢神经系统感染病原体的检测种，如脑脊液NGS检测给神经感染的病原学检查带来了很大变革，但目前NGS的检测和解读仍存在很多问题，最大的问题在于灵敏度不够高。常见病原体的致病力较强，少量病原体即可致病，而对于少量病原体的检测，NGS并不如传统的培养和PCR方法。综上，同时尽可能多的对中枢神经系统感染病原体进行检测仍是中枢神经系统感染病原体检测的发展目标。
技术实现思路
本专利技术是为解决上述技术问题进行的，提供了一种可以同时检测18种中枢神经系统感染病原体的检测试剂盒，采用的技术为多重荧光PCR技术，采用的原理为荧光能量共振转移，通过熔解温度范围判定检测结果，灵敏度高，结果明确易判读。本专利技术的第一方面，提供了一种中枢神经系统感染病原体检测试剂盒，包括反应液、逆转录引物、缓冲液1、缓冲液2、反应酶、内部质控、阳性质控以及稀释液。其中，所述逆转录引物系统包括依次对应人类肠道病毒、流感嗜血杆菌、EB病毒、肺炎链球菌、巨细胞病毒、无乳链球菌、单纯疱疹病毒1型、单核细胞增多性李斯特菌、单纯疱疹病毒2型、脑膜炎奈瑟菌、水痘带状疱疹病毒、双埃可病毒、格特隐球菌、腮腺炎病毒、新生隐球菌、人疱疹病毒6型、大肠杆菌K1以及金黄色葡萄球菌的第一至第十八逆转录引物组，每个引物组均包括正向引物和反向引物，序列如SEQIDNO.1～36所示。缓冲液1和缓冲液2中分别包括用于荧光检测的扩增引物组以及探针。缓冲液1中包括依次对应人类肠道病毒、流感嗜血杆菌、EB病毒、肺炎链球菌、巨细胞病毒、无乳链球菌、单纯疱疹病毒1型、单核细胞增多性李斯特菌、单纯疱疹病毒2型、脑膜炎奈瑟菌、水痘带状疱疹病毒、双埃可病毒的第一至第十二扩增引物组以及第一至第十二探针；缓冲液2中包括依次对应格特隐球菌、腮腺炎病毒、新生隐球菌、人疱疹病毒6型、大肠杆菌K1以及金黄色葡萄球菌的第十三至第十八扩增引物组以及第一探针、第三探针、第四探针、第六探针、第八探针和第九探针。第一至第十八扩增引物组均分别包括正向引物和反向引物，序列如SEQIDNO.37～72所示，第一至第十二探针序列如SEQIDNO.73～84所示。优选的，在本专利技术提供的中枢神经系统感染病原体检测试剂盒中，反应液的规格为375μL，逆转录引物系统的规格为490μL，缓冲液1的规格为1050μL，缓冲液2的规格为1050μL，反应酶的规格为120μL，内部质控的规格为1000μL，阳性质控的规格为110μL，所述稀释液的规格为1700μL。为了方便区分，每种试剂管的管盖颜色不同。优选的，反应液包括储存液和反应酶，储存液与反应酶的体积比为3:1，反应酶的浓度为5.00U/μL；逆转录引物系统包括435.4μL的0.1*TE稀释液以及54.6μL的逆转录引物组；反应酶包括Taq酶以及DNA聚合酶；内部质控包括浓度为105pfu/μL的MS2噬菌体以及SMbuffer，MS2噬菌体溶液的体积百分比为0.1‰；阳性质控包括超纯水、100XEDTA缓冲液、10mg/μLherringsperm以及105c//μL质控人工合成片段，该人工合成片段为十八个病原体保守区域片段，每支阳性质控管由104.94μL超纯水、1.100μLEDTA缓冲液、0.110μLherringsperm以及3.85μL质控人工合成片段组成；稀释液为超纯水。其中，在内部质控中，MS2噬菌体的正、反向逆转录引物序列分别如SEQIDNO.85和86所示，正、反向扩增引物序列分别如SEQIDNO.87和88所示，探针序列如SEQIDNO.89所示。上述所述引物和探针的具体序列在具体实施方式中进行详细描述。优选的，缓冲液1的组成如下：缓冲液2的组成如下：成份每支用量(μL)0.1*TE稀释液847.031*TE稀释液9.6910*PCRbuffer143.75dNTP10.50第十三至第十八扩增引物组9.73第一、三、四、六、八、九探针28.30扩增质控21.00总体积1050所述扩增质控1，扩增质控2均为人工合成片段，两个扩增质控的探针序列如SEQIDNO.90所示。优选的，缓冲液1、所述缓冲液2以及反应酶被配置成两个反应体系，反应体系1包括缓冲液1和反应酶，反应体系2包括缓冲液2和反应酶。缓冲液1和缓冲液2与反应酶的体积比均为19:1。优选的，采用该试剂盒进行检测时，通过逆转录扩增反应以及荧光检测扩增反应完成，第一步扩增反应体系包括6.25μL反应液、8.75μL逆转录引物系统、10μL提取的核酸样本，反应温度设置程序如下：第二步扩增反应体系包括20μL反应体系1、20μL反应体系2以及分别加入至所述反应体系1和反应体系2中的5μL第一步扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种中枢神经系统感染病原体检测试剂盒，其特征在于，包括反应液、逆转录引物、缓冲液1、缓冲液2、反应酶、内部质控、阳性质控以及稀释液，/n所述逆转录引物包括依次对应人类肠道病毒、流感嗜血杆菌、EB病毒、肺炎链球菌、巨细胞病毒、无乳链球菌、单纯疱疹病毒1型、单核细胞增多性李斯特菌、单纯疱疹病毒2型、脑膜炎奈瑟菌、水痘带状疱疹病毒、双埃可病毒、格特隐球菌、腮腺炎病毒、新生隐球菌、人疱疹病毒6型、大肠杆菌K1以及金黄色葡萄球菌的第一至第十八逆转录引物组，每个引物组均包括正向引物和反向引物，序列如SEQ ID NO.1～36所示；/n所述缓冲液1和缓冲液2中分别包括用于荧光检测的扩增引物组以及探针，/n所述缓冲液1中包括依次对应人类肠道病毒、流感嗜血杆菌、EB病毒、肺炎链球菌、巨细胞病毒、无乳链球菌、单纯疱疹病毒1型、单核细胞增多性李斯特菌、单纯疱疹病毒2型、脑膜炎奈瑟菌、水痘带状疱疹病毒、双埃可病毒的第一至第十二扩增引物组以及第一至第十二探针，/n所述缓冲液2中包括依次对应格特隐球菌、腮腺炎病毒、新生隐球菌、人疱疹病毒6型、大肠杆菌K1以及金黄色葡萄球菌的第十三至第十八扩增引物组以及第一探针、第三探针、第四探针、第六探针、第八探针和第九探针，/n所述第一至第十八扩增引物组均分别包括正向引物和反向引物，序列如SEQ ID NO.37～72所示，所述第一至第十二探针序列如SEQ ID NO.73～84所示。/n...

【技术特征摘要】
1.一种中枢神经系统感染病原体检测试剂盒，其特征在于，包括反应液、逆转录引物、缓冲液1、缓冲液2、反应酶、内部质控、阳性质控以及稀释液，
所述逆转录引物包括依次对应人类肠道病毒、流感嗜血杆菌、EB病毒、肺炎链球菌、巨细胞病毒、无乳链球菌、单纯疱疹病毒1型、单核细胞增多性李斯特菌、单纯疱疹病毒2型、脑膜炎奈瑟菌、水痘带状疱疹病毒、双埃可病毒、格特隐球菌、腮腺炎病毒、新生隐球菌、人疱疹病毒6型、大肠杆菌K1以及金黄色葡萄球菌的第一至第十八逆转录引物组，每个引物组均包括正向引物和反向引物，序列如SEQIDNO.1～36所示；
所述缓冲液1和缓冲液2中分别包括用于荧光检测的扩增引物组以及探针，
所述缓冲液1中包括依次对应人类肠道病毒、流感嗜血杆菌、EB病毒、肺炎链球菌、巨细胞病毒、无乳链球菌、单纯疱疹病毒1型、单核细胞增多性李斯特菌、单纯疱疹病毒2型、脑膜炎奈瑟菌、水痘带状疱疹病毒、双埃可病毒的第一至第十二扩增引物组以及第一至第十二探针，
所述缓冲液2中包括依次对应格特隐球菌、腮腺炎病毒、新生隐球菌、人疱疹病毒6型、大肠杆菌K1以及金黄色葡萄球菌的第十三至第十八扩增引物组以及第一探针、第三探针、第四探针、第六探针、第八探针和第九探针，
所述第一至第十八扩增引物组均分别包括正向引物和反向引物，序列如SEQIDNO.37～72所示，所述第一至第十二探针序列如SEQIDNO.73～84所示。


2.根据权利要求1所述的中枢神经系统感染病原体检测试剂盒，其特征在于，
其中，所述反应液的规格为375μL，所述逆转录引物系统的规格为490μL，所述缓冲液1的规格为1050μL，所述缓冲液2的规格为1050μL，所述反应酶的规格为120μL，所述内部质控的规格为1000μL，所述阳性质控的规格为110μL，所述稀释液的规格为1700μL，
每种试剂管的管盖颜色不同。


3.根据权利要求2所述的中枢神经系统感染病原体检测试剂盒，其特征在于，
其中，所述反应液包括储存液和反应酶，所述储存液与所述反应酶的体积比为3:1，所述反应酶的浓度为5.00U/μL；
所述逆转录引物系统包括435.4μL的0.1*TE稀释液以及54.6μL的逆转录引物；
所述反应酶包括Taq酶以及DNA聚合酶；
所述内部质控包括浓度为105pfu/μL的MS2噬菌体以及SMbuffer，MS2噬菌体溶液的体积百分比为0.1‰；
所述阳性质控包括超纯水、100XEDTA缓冲液、10mg/μLherringsperm以及105c/μL质控人工合成片段，该质控人工合成片段为十八个病原体保守区域片段，每支阳性质控管由104.94μL超纯水、1.100μLEDTA缓冲液、0.110μLherringsperm以及3.85μL质控人工合成片段组成；
所述稀释液为超纯水，
所述内部质控中，MS2噬菌体的正、反向逆转录引物序列分别如SEQIDNO.85和86所示，正、反向扩增引物序列分别如SEQIDNO.87和88所示，探针序列如SEQIDNO.89所示。


4.根据权利要求3所述的中枢神经系统感染病原体检测试剂盒，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏小凯，程鲁向，程天龄，杜金凤，董江锴，乔豪先，
申请(专利权)人：上海捷诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31