一种对蜂房哈夫尼亚菌PCM1188血清型O抗原分子分型的检测方法技术

本发明专利技术涉及对蜂房哈夫尼亚菌（

【技术实现步骤摘要】
一种对蜂房哈夫尼亚菌PCM1188血清型O抗原分子分型的检测方法
本专利技术涉及对样品中蜂房哈夫尼亚菌PCM1188血清型菌株O抗原分型的Taqman-MGB技术及其制备方法。本专利技术还设计利用所述的MGB探针进行检测的方法。
技术介绍
蜂房哈夫尼亚菌，是一种兼性厌氧的革兰氏阴性菌，具有呼吸与发酵两种代谢方式。它是一种罕见的人类病原体及条件致病菌，能引发多种如严重的腹泻、败血症、呼吸道感染、尿路感染及其他感染疾病，并且可能对免疫功能低下的患者引起急性肠胃炎，也被认为是诱发肠外疾病的病因。在血清水平上，利用蜂房哈夫尼亚菌抗血清进行鉴定受到变异、可用性和特异性的限制，所以需要一个更具体可行的分子分型方案。已知细菌表面多糖对不同的血清有特异性，如O抗原或荚膜，所以根据O抗原的多样性可以对蜂房哈夫尼亚菌的不同菌株进行分型鉴定。TaqMan-MGB实时荧光PCR（Real-timefluorescencePCR）技术原理：将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值。TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，其5'末端携带荧光基团，如FAM、TET、VIC、HEX等，3'端携带淬灭基团，如TAMRA、BHQ等。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。TaqMan-MGB探针是近年来在TaqMan探针的基础上改进的一种新技术,它在探针3′端增加了MGB分子，这种物质能够提高探针的退火温度(Tm值)，从而使它能够分辨1个碱基的差别，完全配对，有荧光信号；只要有一个碱基不匹配,就没有信号。探针的设计首先为15-30nt长度，Tm为68-70℃。在探针的5'末端，避免了可能引起荧光猝灭的G的存在。探针由AuGCTBiotechnologyCorporation（中国北京）合成，分别在5'和3'末端具有6-羧基荧光素（FAM）和小沟结合（MGB）部分。引物的长度约为25nt，Tm在55-60℃之间。产生的PCR产物在50-200bp之间。引物由Invitrogen（中国上海）合成。如果正向引物的3'末端距离探针的5'末端1-20nt（通常为10nt或更少），则可能更好。利用TaqmanMGBPCR检测时，扩增反应在25μL的总体积中进行，包括12.5μLPremixExTaqTM（Takara），0.3μL各10μM正向和反向引物，0.3μL10μM探针，0.2μLROXII，0.3μLDNA和11μlddH2O。一个方案包括在95℃下进行3分钟的初始变性步骤，然后在95℃下变性15秒，在57℃下退火45秒进行40个循环，一式三份进行7500实时PCR系统（AppliedBiosystems，FosterCity，CA，USA），随后利用仪器（如ABI7500）进行检测和结果分析。Ct值<30且出现扩增曲线则为阳性。
技术实现思路
为实现上述目的，本专利技术公开了对样品中蜂房哈夫尼亚菌PCM1188血清型O抗原分型的MGB探针，该探针含有5'报告染料（FAM）和3'非荧光猝灭剂（NFQ），在3'末端与小沟结合物（MGB）缀合；其主要特征在于所述的蜂房哈夫尼亚菌PCM1188血清型O抗原分型指的是：从蜂房哈夫尼亚菌PCM1188血清型的O抗原基因簇特异基因序列，具有从SEQIDNO:3所示的DNA序列。本专利技术所述对样品中蜂房哈夫尼亚菌PCM1188血清型O抗原分型的TaqMan引物，其特征在于所述的引物序列：具有SEQIDNO:1-SEQIDNO:2所示的引物。本专利技术进一步公开了对样品中蜂房哈夫尼亚菌PCM1188血清型O抗原分型的MGB探针，用于特异性快速检测蜂房哈夫尼亚菌PCM1188血清型O抗原分型方面的应用。其中该MGB探针用于蜂房哈夫尼亚菌PCM1188血清型中的O抗原分型检测。所述的蜂房哈夫尼亚菌指的是分离于任何适合蜂房哈夫尼亚菌生活的环境中所得到的样品的纯培养物的粗提。实验结果显示：（1）本专利技术对于蜂房哈夫尼亚菌PCM1188血清型基因组样品的灵敏度为0.9pg；（2）本专利技术可以在较低的DNA浓度下对蜂房哈夫尼亚菌PCM1188血清型O抗原进行分型。本专利技术提供的一种检测环境中蜂房哈夫尼亚菌PCM1188血清型的Taqman-MGBPCR体系，该体系包括：PremixExTaqTM（Takara），10μM正向和反向引物，10μM探针，ROXII，0.3μLDNA和ddH2O。其主要特征在于所述的根据从蜂房哈夫尼亚菌PCM1188血清型的O抗原基因簇特异基因序列设计的引物和探针：（1）从蜂房哈夫尼亚菌PCM1188血清型的O抗原基因簇特异基因序列中用PrimerExpress3.0设计的引物长度约为25nt，Tm在55-60℃之间；PCR产物在50-200bp之间。如果正向引物的3'末端距离探针的5'末端1-20nt（通常为10nt或更少），则可能更好。（2）从蜂房哈夫尼亚菌PCM1188血清型的O抗原基因簇特异基因序列中用PrimerExpress3.0设计的探针长度为15-30nt，Tm为68-70℃。在探针的5'末端，避免了可能引起荧光猝灭的G的存在，分别在5'和3'末端具有6-羧基荧光素（FAM）和小沟结合（MGB）部分。本专利技术是Taqman-MGBPCR技术的实际应用，用于蜂房哈夫尼亚菌PCM1188血清型血清型分型鉴定。由上述的技术方案可见，本专利技术首次将Taqman-MGBPCR技术引入蜂房哈夫尼亚菌PCM1188血清型O抗原分型领域，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的样品中蜂房哈夫尼亚菌PCM1188血清型检测MGB探针及其检测方法，利用本专利技术的MGB探针可以达到鉴定样品中常见的PCM1188菌株的目的，由于操作简便，准确性高，重复性强，该专利技术对于各级医疗部门实时快速检测样品中蜂房哈夫尼亚菌PCM1188血清型分型具有重要的应用价值。附图说明图1蜂房哈夫尼亚菌PCM1188血清型探针自身阳性结果：PCM1188：Ct=16.13；图2A-图2T为PCM1188探针特异性检测：其中，图2A为PCM1189-1188：Ct值为35.15；图2B为PCM1191-1188：Ct值为31.88；图2C为PCM1192-1188：Ct值为37.09；图2D为PCM1194-1188：Ct值为32.15；图2E为PCM1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对样品中蜂房哈夫尼亚菌PCM1188血清型O抗原分型的Taqman特异性引物，其特征在于所述的引物序列：具有SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:2所示的特异性核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种对样品中蜂房哈夫尼亚菌PCM1188血清型O抗原分型的Taqman特异性引物，其特征在于所述的引物序列：具有SEQIDNO:1-SEQIDNO:2所示的特异性核苷酸序列。


2.一种含有权利要求1所述特异性引物的MGB探针，该探针含有5'报告染料（FAM）和3'非荧光猝灭剂（NFQ），在3'末端与小沟结合物（MGB）缀合；其主要特征在于具有SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：王磊，李樾华，宁可馨，曹勃阳，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津;12