本发明专利技术公开了一种酮还原酶、其编码基因、其核酸的重组表达载体、重组表达转化体及其制备方法，以及该酮还原酶在替格瑞洛中间体合成中的应用。本发明专利技术的酮还原酶为2‑氯‑1‑(3,4‑二氟苯基)乙酮转化合成(S)‑2‑氯‑1‑(3,4‑二氟苯基)乙醇的生物催化合成提供了可供选择的新酶源，其催化能力高效，在不添加昂贵的辅酶的情况下，含本发明专利技术的酮还原酶的全细胞可催化高浓度底物完全转化，能够进一步降低生产成本。
【技术实现步骤摘要】
酮还原酶及其在替格瑞洛中间体合成中的应用
本专利技术涉及一种酮还原酶及其替格瑞洛中间体合成中的应用。
技术介绍
替格瑞洛(Ticagrelor)是一类新型环戊基三唑嘧啶类抗血小板聚集药物，2010年在欧洲上市，2012年11月在我国上市，同年我国PCI指南也将其列为抗血小板治疗药物之一，目前已成为国外许多ACS治疗指南推荐的抗血小板治疗用药。酮还原酶(EC1.1.1.X，X＝1，2)也被称为羰基还原酶(Carbonylreductase，CR)或醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase，ADH)，它们可逆地催化酮或者醛还原为醇，并需要辅助因子的参与。微生物细胞或者微生物来源的羰基还原酶可以高效地催化前手性酮的还原，是制备手性醇分子的重要方法之一。天然酶在工业应用中普遍存在无法适应工业生产条件和对非天然底物的催化能力低等问题。CN105671099A、CN106047828A、CN109423484A、CN106906249A、CN106701840A、CN107686447A、CN109295020A和CN109112166A等专利文献中给出了采用生物酶催化法制备替格瑞诺手性中间体(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的方法。CN105671099A中的实施例表明其反应体系催化能力最高仅能达到100g/L，底物浓度的提升至150g/L，底物转化率由99.6％降低至89％。CN106047828A中，突变体L205A转化底物的浓度可以提升至200g/L，但需要的反应时间达到20h，其应用价值仍有待提高。CN109423484A中公开的酮还原酶能够转化底物浓度高达350g/L的底物，但需要加入价格昂贵的NADP辅酶才能完全转化反应，也限制了其工业应用范围。CN106906249A和CN106701840A中，转化底物浓度分别为133g/L和38g/L，与后续工业化应用均有一定的距离。CN107686447A、CN109295020A和CN109112166A均使用葡萄糖脱氢酶实现了辅酶再生，但是底物葡萄糖在葡萄糖脱氢酶作用下反应生成葡糖酸，给后续纯化带来了很大的挑战。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，针对现有2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮的酶催化反应存在的问题，本专利技术对一种新来源的酮还原酶序列，经定点突变技术进行分子改造，从而获得活性提高的酮还原酶KRED突变体，提高酶的底物催化能力。本专利技术的酮还原酶的氨基酸序列，其来源于Leifsoniapoae的酮还原酶KRED，该酶基因大小为759bp，编码251个氨基酸，NCBI登录号为BAP47552。本专利技术提供了一种酮还原酶，其为由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的第146号位氨基酸、第154号位氨基酸、第194号位氨基酸和第206号位氨基酸中的一个或多个进行突变后所形成的新氨基酸序列构成的酮还原酶；其中，突变子为：(1)L146A(亮氨酸突变为丙氨酸)、L146I(亮氨酸突变为异亮氨酸)或L146V(亮氨酸突变为缬氨酸)；(2)S154Y(丝氨酸突变为酪氨酸)、S154T(丝氨酸突变为苏氨酸)、S154F(丝氨酸突变为苯丙氨酸)或S154W(丝氨酸突变为色氨酸)；(3)L194I(亮氨酸突变为异亮氨酸)；和/或，(4)F206A(苯丙氨酸突变为丙氨酸)、F206G(苯丙氨酸突变为甘氨酸)、F206L(苯丙氨酸突变为亮氨酸)或F206V(苯丙氨酸突变为缬氨酸)。优选的组合突变为：S154Y/L146A、S154Y/L146I、S154Y/F206A、S154Y/F206L、S154Y/L194I、S154Y/L194I/L146A、S154Y/L194I/L146I、S154Y/L194I/F206A、S154Y/L194I/F206L或S154Y/L194I/L146A/F206A。按本领域常识，酮还原酶一般可由基因工程菌发酵等方法获得，不限制其来源；所述基因工程菌可选自枯草芽孢杆菌、酵母菌或大肠杆菌，优选大肠杆菌。因而，本专利技术还提供了一种酮还原酶，其氨基酸序列中的第146号位、第154号位、第194号位和第206号位处的氨基酸为下述(1)～(4)中的一种或多种，其余的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示；(1)第146号位的氨基酸为丙氨酸、异亮氨酸或缬氨酸；(2)第154号位的氨基酸为酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸或色氨酸；(3)第194号位的氨基酸为异亮氨酸；(4)第206号位的氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸或缬氨酸。在本专利技术一些优选的具体实施方式中，所述酮还原酶的氨基酸序列为SEQIDNo.4、SEQIDNo.6、SEQIDNo.8、SEQIDNo.10、SEQIDNo.12、SEQIDNo.14、SEQIDNo.16、SEQIDNo.18、SEQIDNo.20、SEQIDNo.22、SEQIDNo.24、SEQIDNo.26、SEQIDNo.28、SEQIDNo.30、SEQIDNo.32、SEQIDNo.34、SEQIDNo.36、SEQIDNo.38或SEQIDNo.40。本专利技术还提供了一种所述酮还原酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列以SEQIDNo.1所示的序列为出发序列，根据所述酮还原酶的氨基酸与SEQIDNo.2的差异，对密码子进行突变后得到：L146A：DNA序列中146号位氨基酸的密码子由CTG突变为GCT；L146I：DNA序列中146号位氨基酸的密码子由CTG突变为ATT；L146V：DNA序列中146号位氨基酸的密码子由CTG突变为GTT；S154Y：DNA序列中154号位氨基酸的密码子由AGC突变为TAC；S154T：DNA序列中154号位氨基酸的密码子由AGC突变为ACT；S154F：DNA序列中154号位氨基酸的密码子由AGC突变为TTC；S154W：DNA序列中154号位氨基酸的密码子由AGC突变为TGG；L194I：DNA序列中194号位氨基酸的密码子CTG突变为ATT；F206A：DNA序列中206号位氨基酸的密码子由TTT突变为GCT；F206G：DNA序列中206号位氨基酸的密码子由TTT突变为GGT；F206L：DNA序列中206号位氨基酸的密码子由TTT突变为CTT；F206V：DNA序列中206号位氨基酸的密码子由TTT突变为GTT。在本专利技术一些优选的具体实施方式中，所述酮还原酶的编码基因的多核苷酸序列为SEQIDNo.3、SEQIDNo.5、SEQIDNo.7、SEQIDNo.9、SEQIDNo.11、SEQIDNo.13、SEQIDNo.15、SEQIDNo.17、SEQIDNo.19、SEQIDNo.21、SEQIDNo.23、SEQIDNo.25、SEQIDNo.27、SEQIDNo.29、SEQIDNo.31、SEQIDNo.33、S本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种酮还原酶，其特征在于，其氨基酸序列中的第146号位、第154号位、第194号位和第206号位处的氨基酸为下述(1)～(4)中的一种或多种，其余的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；/n(1)第146号位的氨基酸为丙氨酸、异亮氨酸或缬氨酸；/n(2)第154号位的氨基酸为酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸或色氨酸；/n(3)第194号位的氨基酸为异亮氨酸；/n(4)第206号位的氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸或缬氨酸。/n
【技术特征摘要】
1.一种酮还原酶，其特征在于，其氨基酸序列中的第146号位、第154号位、第194号位和第206号位处的氨基酸为下述(1)～(4)中的一种或多种，其余的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示；
(1)第146号位的氨基酸为丙氨酸、异亮氨酸或缬氨酸；
(2)第154号位的氨基酸为酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸或色氨酸；
(3)第194号位的氨基酸为异亮氨酸；
(4)第206号位的氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸或缬氨酸。
2.如权利要求1所述的酮还原酶，其特征在于，所述酮还原酶的氨基酸序列为SEQIDNo.4、SEQIDNo.6、SEQIDNo.8、SEQIDNo.10、SEQIDNo.12、SEQIDNo.14、SEQIDNo.16、SEQIDNo.18、SEQIDNo.20、SEQIDNo.22、SEQIDNo.24、SEQIDNo.26、SEQIDNo.28、SEQIDNo.30、SEQIDNo.32、SEQIDNo.34、SEQIDNo.36、SEQIDNo.38或SEQIDNo.40。
3.一种如权利要求1或2所述的酮还原酶的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列以SEQIDNo.1所示的序列为出发序列，根据所述酮还原酶的氨基酸与SEQIDNo.2的差异，对密码子进行突变后得到：
L146A：DNA序列中146号位氨基酸的密码子由CTG突变为GCT；
L146I：DNA序列中146号位氨基酸的密码子由CTG突变为ATT；
L146V：DNA序列中146号位氨基酸的密码子由CTG突变为GTT；
S154Y：DNA序列中154号位氨基酸的密码子由AGC突变为TAC；
S154T：DNA序列中154号位氨基酸的密码子由AGC突变为ACT；
S154F：DNA序列中154号位氨基酸的密码子由AGC突变为TTC；
S154W：DNA序列中154号位氨基酸的密码子由AGC突变为TGG；
L194I：DNA序列中194号位氨基酸的密码子CTG突变为ATT；
F206A：DNA序列中206号位氨基酸的密码子由TTT突变为GCT；
F206G：DN...
【专利技术属性】
技术研发人员：金圣芳，张敏洁，张敏，袁豹，
申请(专利权)人：上海京新生物医药有限公司，上虞京新药业有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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