活化淋巴细胞特异性的检测方法技术

一种检测机体活化淋巴细胞特异性的方法，此方法包括：　　　　１）制备检测用抗原，并用培养基稀释；所述抗原能使机体的淋巴细胞活化；所述培养基除包含常规细胞培养所需成分外，还添加了免疫抑制剂和／或抗肿瘤药和对细胞增殖具有刺激活性的细胞因子的中和抗体和／或对单个核细胞具有抑制活化和抑制增殖作用的细胞因子；　　　　２）用所述培养基制备包含待检活化淋巴细胞的单个核细胞；　　　　３）将所述检测用抗原、含待检活化淋巴细胞的单个核细胞加入细胞培养板中一起培养；　　　　４）通过比较试验孔与阴性对照孔的可检测信号的差异，来确定检测样品中是否存在抗原特异的活化淋巴细胞。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及同种异体或异种器官移植后，或机体受病毒、细菌如结核杆菌感染或接种各种疫苗后，检测体内活化淋巴细胞的特异性的方法。
技术介绍
免疫(immune)或免疫性(immunity)是生物识别和清除抗原性异物的一种生理性反应。引起免疫的抗原物质大多不是生物体自身的，而是外源性物质，它们进入生物体后能被机体的免疫系统迅速识别，并通过一系列免疫应答过程予以消灭，使机体恢复原来的平衡状态。 在进行器官移植时，供受体间的抗原性差异如主要组织相容性抗原(major histocompatibility antigen MHC)和次要组织相容性抗原(mH-antigen)的不同，就可刺激受体产生针对供体器官存在的与受体不同的抗原的特异性活化淋巴细胞，这些特异性活化淋巴细胞就会攻击供体器官产生排斥反应。当机体受病原微生物感染，如麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型及庚型肝炎病毒、水痘和带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、冠状病毒、轮状病毒、柯萨基病毒、埃可病毒(ECHO)、埃博拉病毒、黄热病毒、腺病毒、森林脑炎病毒、风疹病毒、登革热病毒、流行性乙型脑炎病毒、狂犬病毒、SARS病毒、流行性感冒病毒(包括人、禽)流行性腮腺炎病毒、出血热病毒、艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒、立克次体、流行性脑炎双球菌、伤寒或副伤寒杆菌、结核杆菌、白喉杆菌、百日咳杆菌、炭疽杆菌、布氏杆菌、鼠疫耶尔森菌、麻疯杆菌、非典型分枝杆菌、钩端螺旋体、梅毒螺旋体、回归热螺旋体、衣原体、支原体、隐孢子虫、利什曼原虫、弓形虫、日本血吸虫、并殖吸虫、华支睾吸虫、姜片虫、丝虫、等感染时同样会刺激机体产生分别针对各种病原微生物的特异性活化淋巴细胞；在同一个机体中可能同时存在多种特异性的、分别针对多种不同抗原的活化淋巴细胞，如一个心脏移植后出现排斥反应的患者感染了疱疹病毒，那么在该患者体内，即有特异性针对供体器官主要组织相容性或次要组织相容性抗原的活化淋巴细胞，又有特异性针对疱疹病毒的活化淋巴细胞存在。 器官移植是治疗许多器官终末期疾病的唯一方法。在器官移植后，供受体间MHC和mH抗原的差异将引起排斥反应，排斥反应仍是目前影响心、肝、肾、骨髓等器官或细胞移植后，3年、5年、10年存活率的主要因素，而排斥反应的发生首先开始于淋巴细胞的活化。如果受者体内出现抗供体特异性活化淋巴细胞，则预示着机体可能启动了攻击供体器官的反应，提示人们尽早采取针对性的措施，如增加免疫抑制剂剂量或更换免疫抑制剂种类等，从而使供体器官在受体体内保持一个良好的功能状态，进而提高移植受者的生存质量和生存期限。 目前活检穿刺仍是世界上各移植中心诊断排斥反应的根本方法和唯一标准，但由于活检穿刺本身具有一定的危险性，不宜多做，而且费用昂贵，病人比较痛苦，不易为医生和病人所接受。而且一个移植器官如心、肝、肾等，即使发生排斥反应，其病变也不是均一的，而是有的部位有、有的部位无，有的轻、有的重。活检穿刺只能从器官的局部取材，容易误诊；另外活检病理观察，主要是看病理学改变，一旦出现病理学改变，也就表明器官已经受到了损害；为建立一个方便、快速、敏感的非侵入性的器官移植排斥反应诊断方法，国内外研究者做了大量工作，尝试了很多方法和标志物，结果均不理想。所以，提供一个方便、快速、准确、敏感的排斥反应非侵入性诊断方法，对提高移植患者的生存质量和延长移植器官的使用期限，具有重要意义；而且排斥反应的发生首先开始于淋巴细胞的活化，活化淋巴细胞的出现应早于病理改变。本专利技术主要是通过检测外周血中被MHC或mH抗原活化的特异性淋巴细胞来诊断排斥反应，所以本方法对排斥反应的诊断应早于移植器官的病理改变。另外，本方法简便易行，可自动操作，易标准化，克服了上述活检穿刺方法的缺陷，能对诊断排斥反应提供快速、准确、清楚的测试结果。所以该方法的应用对指导临床调整免疫抑制剂用量，延长移植物存活期限，提高移植患者生存质量，将会有极为重要的意义。 在病原微生物感染方面，如乙脑病毒、麻疹病毒、水痘病毒、结核杆菌等许多感染性疾病均有一个潜伏期，在这期间及发病早期大多只表现为非特异症状如发热等，无特异性表现，而这些疾病的诊断常常依赖于该病典型临床症状(特异性表现)的出现，但典型症状出现一般较晚；有些甚至一直没有典型症状，常导致误诊，延误病情，引起严重后果。 本专利技术应用在病原微生物感染诊断方面，可提供一个能在潜伏期或发病早期快速准确进行确诊的方法，对各种传染病早发现、早隔离、早治疗，避免传染和流行，也将具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术适用于检测任何抗原刺激机体所产生的活化淋巴细胞的特异性。 本专利技术所使用的抗原为同种异体抗原，异种抗原或各种病原微生物的抗原。同种异体抗原或异种抗原样品可以是一种抗原也可以是来自一个个体或多个个体的混合抗原，其存在形式可以是以颗粒抗原的形式存在于人或动物细胞膜上或存在于霉菌、细菌的细胞膜或细胞壁上或存在于病毒包膜或衣壳上。也可以是以可溶性抗原的形式溶解在溶液中。 同种异体抗原是等位基因的直接或间接产物，该等位基因的产物可作为抗原被同一物种的另一成员所识别。该等位基因的产物不但有多肽，而且还有特异多糖和由等位基因编码的酶合成的脂类。本专利技术中所用的同种异体抗原属组织相容性抗原，包括主要组织相容性抗原(MHC)(在人类称为“HLA”，猪称为“SLA”，猴称为“MAMU”，黄狒狒为“PACY”，小鼠的为H2抗原，大鼠的为RT1抗原等)和次要组织相容性抗原(mH-antigen)两组。 异种抗原是指两物种间一物种具有而另一物种所不具有的、能被另一物种识别产生免疫应答的物质，如多肽、特异性多糖，脂类等。如将猪器官对人、猴、狒狒、黑猩猩等移植时，猪体内所具有而人、猴、狒狒、黑猩猩等体内所不具有的上述物质即为异种抗原。 病原微生物抗原可以是一种细菌或病毒的某一个特异性抗原，也可以是这种细菌或病毒的混合抗原(每一种细菌或病毒都表达许多种抗原)，其存在形式可以是经非离子去垢剂、脂溶剂或10％甲醛处理的细菌或病毒颗粒，也可以把细菌或病毒抗原表达在人或动物细胞株的细胞膜上，还可以是以可溶性抗原的形式溶解于溶液中。 本专利技术中的目的抗原是指被检测者体内可能含有其特异性活化淋巴细胞的、通过检测希望证实或排除的检测用抗原。 本专利技术中的无关抗原是指在被检测者体内不可能含有其特异性活化淋巴细胞，在检测中作为阴性对照的抗原。无关抗原根据检测目的不同而不同，可另外添加，也可在一个检测板内相互作为阴性对照抗原。 本专利技术所使用的抗原可以是颗粒性抗原，如携带某个或某些人类HLA抗原的细胞、细菌或病毒，或携带某个病毒或细菌抗原的细胞、细菌或病毒等；也可以是可溶性抗原，如同种异体或异种抗原分子或某个病毒或细菌的某个特异性蛋白分子。 本专利技术所使用的抗原可以是一种同种异体或异种抗原分子，也可以是多种或人类全部HLA及mH抗原分子的混合物；是一种病毒或细菌的特异性抗原，也可以是几种病毒或细菌的混合抗原。用单一抗原和混合抗原的区别在于结果提示诊断的精确性不同，如用同种异体抗原的混合抗原做检测，其阳性结果只能提示有同种异体抗原特异性活化的淋巴细胞，即机体已启动了攻击供体器官的排斥反应，而不能确定是哪一个抗原诱本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡军，
申请(专利权)人：胡军，
类型：发明
国别省市：