一种艰难梭菌抗原及多克隆抗体的制备方法和检测试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种艰难梭菌抗原及多克隆抗体的制备方法和检测试剂盒，涉及免疫检测技术领域。本发明专利技术利用独属于艰难梭菌的抗原表位TcdB1和TcdB2作为抗原决定簇，利用单个抗原表位连接钥孔血蓝蛋白后免疫实验兔，得到高纯度、高效价及高特异性的多克隆抗体。本发明专利技术基于所述多克隆抗体提供了一种双抗体夹心ELISA试剂盒用于检测艰难梭菌，所建立的检测方法更为科学、严谨；同时满足ELISA试剂对灵敏度、特异性、重复性等重要参数的要求。

【技术实现步骤摘要】
一种艰难梭菌抗原及多克隆抗体的制备方法和检测试剂盒
本专利技术属于免疫检测
，具体涉及一种艰难梭菌抗原及多克隆抗体的制备方法和检测试剂盒。
技术介绍
艰难梭菌(Clostridiumdiffcile，CD)为革兰阳性粗大杆菌，有鞭毛，有芽孢的专性厌氧菌，分离培养较为困难。艰难梭菌感染大多数为无症状携带者，临床上艰难梭菌感染(Clostridiumdiffcileinfection，CDI)，可引起轻度腹泻至血样腹泻，严重感染患者可导致假膜性结肠炎、中毒性巨结肠、肠坏死，甚至危及生命。艰难梭菌主要产生两种毒素：肠毒素(TcdA)和细胞毒素(TcdB)。肠毒素能趋化中性粒细胞浸润回肠肠壁，释放细胞因子，导致肠道大量失水和出血性坏死。细胞毒素能解聚肌动蛋白，损坏细胞骨架，导致局部肠壁细胞坏死，有直接损伤肠壁作用。近些年发现了TcdB也具有肠毒素的功能，可单独致病。艰难梭菌的实验室检测是临床诊断CDI的重要依据，但目前国内缺乏标准的艰难梭菌毒素的检测方案，且相关研究较少，使艰难梭菌临床资料匮乏。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种艰难梭菌抗原及多克隆抗体的制备方法和检测试剂盒，从而建立一套完整的艰难梭菌的检测方法，更为科学、严谨，具有检测灵敏度高、特异性行和重复性好等优点。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种艰难梭菌抗原，所述抗原包括将抗原表位TcdB1和TcdB2分别与载体蛋白钥孔血蓝蛋白KLH连接形成的抗原；所述TcdB1的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；所述TcdB2的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。优选的，在所述连接前，还包括分别在所述TcdB1和TcdB2的氨基酸序列的N端添加1个半胱氨酸修饰。本专利技术还提供了一种艰难梭菌的多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：每隔两周对新西兰兔进行一次免疫，在第5次免疫2周后，从血液中分离纯化蛋白，得多克隆抗体Anti-TcdB1或Anti-TcdB2；第一次免疫时，利用所述抗原分别单独与弗氏完全佐剂等体积混匀，乳化后得首次免疫抗原，利用所述的首次免疫抗原免疫兔；第二次至第四次免疫时，利用所述抗原分别单独与弗氏不完全佐剂等体积混匀，乳化后得第二免疫抗原，利用所述第二免疫抗原免疫所述兔；第五次免疫时，利用所述抗原免疫所述兔。优选的，在第一次免疫时，在兔腋下、颈部和背部共5处分别注射所述第一免疫抗原0.1mg；在第二次至第四次免疫时，在第一次免疫的相同位置分别注射所述第二免疫抗原0.1mg；在第五次免疫时，经耳缘静脉注射所述抗原0.1mg。优选的，在每次免疫后1周还包括采集血清，用间接ELISA方法测定血清抗体效价并进行Western-blot验证抗体的特异性。优选的，所述分离纯化，包括将心脏血经4000r/min分离血清，用0.45μm滤器过滤后通过proteinA亲和层析柱分离纯化。本专利技术还提供了一种人艰难梭菌TcdB双抗体夹心ELISA试剂盒，所述试剂盒包括以下成分：96孔板、PBS缓冲液、PBST缓冲液、包被液、封闭液、抗体稀释液显色液、终止液和抗体，所述抗体包括一抗和二抗，所述一抗为利用上述制备方法制备得到的Anti-TcdB1，所述二抗为HRP标记的利用上述制备方法制备得到的Anti-TcdB2。优选的，利用所述试剂盒检测人艰难梭菌前，包括对所述96孔板进行预处理，所述预处理包括：利用所述包被液将Anti-TcdB1稀释至0.5μg/ml，100μl/孔加至96孔板，37℃包被2小时后，转4℃包被8～12h；包被后用所述PBST缓冲液洗板三次；向包被后的板内每孔加入300μl封闭液，置于37℃封闭2小时后，转移至4℃继续封闭8～12h；封闭后用所述PBST缓冲液洗板三次，干燥。优选的，所述包被液包括摩尔浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液，pH值为9.6。优选的，所述抗体稀释液为含BSA的PBST缓冲液，所述BSA和PBST的质量体积比为0.2g：100mL。本专利技术提供了一种艰难梭菌抗原，利用独属于艰难梭菌的抗原表位TcdB1和TcdB2作为抗原决定簇，利用单个抗原表位连接钥孔血蓝蛋白后免疫实验兔，得到高纯度、高效价及高特异性的多克隆抗体，该方法相较于单克隆抗体的制备方法具有更快捷、经济且方便等优点。制备的抗体在理论上具备了单克隆抗体的高特异性同时又具备多克隆抗体的高亲和性，且可用于沉淀、凝集等试验，亦可用于检测变性蛋白。制备流程相较于单克隆抗体更加经济与简便，还具有更加稳定、方便保存的优点。本专利技术基于所述多克隆抗体还提供了一种双抗体夹心ELISA试剂盒用于检测艰难梭菌，所建立的检测方法更为科学、严谨；同时满足ELISA试剂对灵敏度、特异性、重复性等重要参数的要求。本专利技术实施例中对所述抗原表位及构建得到的多克隆抗体进行验证，结果发现，在第四次免疫后，Anti-TcdB1和Anti-TcdB2的抗体效价分别大于1:128000和1:512000，第五次免疫后一周血清抗体效价分别大于1:256000和1:1024000。分别以Anti-TcdB1和Anti-TcdB2为一抗进行Western-blot，抗体与产毒艰难梭菌培养后上清反应条带位于170KDa，而作为阴性对照的非产毒艰难梭菌无此反应条带，证明制备的两种抗体均具有较高的特异性。基于所述多克隆抗体构建得到的双抗体夹心法ELISA检测艰难梭菌时，最低检测限为15.6ng/ml；按已建立的ELISA双抗体夹心法对产毒艰难梭菌、PBS、金黄色葡萄菌和肺炎链球菌等临床常见菌进行检测，产毒艰难梭菌A450值为0.413，判断为阳性；其余均小于阴性临界值0.1776，判断为阴性，未见交叉反应，表明该检测方法特异性强；掉建立的双抗体夹心ELISA法进行批内和批间重复性验证，其中批内阳性检测变异系数为3.62～5.58％，阴性检测变异系数为5.65～8.04％；批间阳性检测变异系数为5.19～7.00％，阴性检测变异系数为6.39～8.21％。批内和批间重复性良好，建立的双抗体夹心ELISA法具有一定的稳定性；按已建立的ELISA检测方法每周进行一次检测，用酶标仪读取OD450值，经过6个周期的检测，阳性结果虽有所降低，但结果判断仍为阳性；阴性结果保持稳定；说明该检测试剂盒稳定性较好。将终浓度为50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml和250ng/ml的CDB3重组蛋白，按已建立的ELISA检测方法进行检测，回收率在91.17～105.33％之间，每个浓度的变异系数为2.35～5.44％，说明建立的ELISA检测方法准确性较高。附图说明图1为Anti-TcdB1和Anti-TcdB2的效价；图2为Anti-TcdB1(左)和Anti-TcdB2(右)的WB试验结果，其中M：蛋白标准分子量，1:TcdB1抗体与产毒菌的反应条带，2:非产毒菌阴性对照3:TcdB2抗体与产毒菌反应条带，4:非产毒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种艰难梭菌抗原，其特征在于，所述抗原包括将抗原表位TcdB1和TcdB2分别与载体蛋白钥孔血蓝蛋白KLH连接形成的抗原；所述TcdB1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述TcdB2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种艰难梭菌抗原，其特征在于，所述抗原包括将抗原表位TcdB1和TcdB2分别与载体蛋白钥孔血蓝蛋白KLH连接形成的抗原；所述TcdB1的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；所述TcdB2的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


2.根据权利要求1所述抗原，其特征在于，在所述连接前，还包括分别在所述TcdB1和TcdB2的氨基酸序列的N端添加1个半胱氨酸修饰。


3.一种艰难梭菌的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：每隔两周对新西兰兔进行一次免疫，在第5次免疫2周后，从血液中分离纯化蛋白，得多克隆抗体Anti-TcdB1或Anti-TcdB2；
第一次免疫时，利用权利要求1或2所述抗原分别单独与弗氏完全佐剂等体积混匀，乳化后得首次免疫抗原，利用所述的首次免疫抗原免疫兔；
第二次至第四次免疫时，利用权利要求1或2所述抗原分别单独与弗氏不完全佐剂等体积混匀，乳化后得第二免疫抗原，利用所述第二免疫抗原免疫所述兔；
第五次免疫时，利用权利要求1或2所述抗原免疫所述兔。


4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，在第一次免疫时，在兔腋下、颈部和背部共5处分别注射所述第一免疫抗原0.1mg；
在第二次至第四次免疫时，在第一次免疫的相同位置分别注射所述第二免疫抗原0.1mg；
在第五次免疫时，经耳缘静脉注射权利要求1或2所述抗原0.1mg。


5.根据权利要求3或4所述制备方法，其特征在于，在每次免疫后1周还包括采集血清，用间接ELISA方法测定血...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐广贤，潘俊斐，张爱君，楚元奎，王红霞，蒋丹，屈煜良，李光琪，李燕宁，
申请(专利权)人：宁夏医科大学，
类型：发明
国别省市：宁夏;64