通过系列组合稀释定量制造技术

本发明专利技术提供了用于对生物分子的复杂混合物中定量生物分子的方法，其包括将生物分子混合物分级以提供至少两个级分，其中每个级分具有至少一种不同组分。这些级分随后接受系列组合稀释。接着，通过提供了灵敏度阈和鉴定信息的方法使在级分中的生物分子得以检测和鉴定。通过考虑各自的稀释因子，加和各个稀释水平上各个级分中鉴定的生物分子数目，生物分子的量得以确定。为了归一化，用此和除以所有稀释水平上所有级分中所有生物分子的鉴定总数目。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于生物分子的复杂混合物中生物分子的定量方法，方法包括将复杂混合物分级为级分，随后将级分进行系列组合稀释以及通过具有定义的灵敏度阈和鉴定能力的方法检测每一初始级分和每一稀释级分中的生物分子。当前用于生物分子(例如蛋白)的检测方法是进行双向凝胶电泳并随后对经染色凝胶进行容量分析。然而，很难确定被分析的生物分子的量，尤其是如果要比较它在不同样品中的量时。为了解决样品间生物分子浓度的不同，凝胶必须平行处理并且必须进行凝胶对凝胶的匹配。需要一种用于生物分子的复杂混合物中对生物分子定量的简单方法。本专利技术提供了一种用于生物分子的复杂混合物中定量生物分子的方法，其包括a.提供来自于对生物分子的复杂混合物进行分级获得的至少两种级分，其中所述每一级分包含至少一种不同的生物分子组分，b.将所述级分进行系列组合稀释步骤，c.用具有稳定的和充分定义的灵敏度阈和鉴定信息的方法检测和鉴定在每一初始级分和每一稀释级分中的生物分子，以及d.通过考虑各自的稀释因子，加和每一稀释水平上每一级分中生物分子的鉴定数目，从而定量生物分子复杂混合物中的生物分子。为了归一化，可以用d)的总数除以全部稀释水平上全部级分(初始级分和稀释级分)中全部生物分子的鉴定总数目。用于定量生物分子的本专利技术方法提供了将来自一种来源的生物分子复杂混合物中一种或多种生物分子与来自其它来源的复杂混合物中相应的分子进行比较的相对定量法。生物分子的复杂混合物可以来自任何来源，包括生物来源，生物来源包括细胞、细胞培养上清液、生物液体例如血清、血浆、尿、支气管灌洗液、痰液、活组织解剖物像脑脊髓液。生物分子的复杂混合物包含至少两种不同生物分子。本专利技术中的生物分子可以是任何生物分子，包括多聚核苷酸、多肽、碳水化合物、脂类、糖蛋白、脂蛋白、或它们的其它修饰形式或代谢物。检测和鉴定方法可以限制为对单种生物分子进行检测和鉴定，或一次可以检测和分析几类生物分子。用于本专利技术方法的分级方法应该有效地将生物分子的复杂混合物分离为不同级分。优选地，生物分子的复杂混合物被分级成不同级分，使得每一不同的生物分子至多仅存在于n-1个级分中，其中n是级分的总数并且n等于或大于2。优选地，不同生物分子存在于两个不同的级分中，更优选地在一个级分中。可以用于本专利技术的分级方法可以选自适用于目标种类生物分子复杂混合物分离的任何方法。可以用于本专利技术方法的分级方法可以选自基于吸附、重力或沉降速度的分级方法、电泳分级方法或这些方法的组合。例如，在蛋白作为目标分子的情况下，所述分级方法包括但不限于色谱分级法、超速离心法、蛋白沉淀法、亲和纯化法或免疫沉淀法。在肽(例如从蛋白水解消化物得到)作为目标分子的情况下，所述分级方法包括但不限于高压液相色谱法(HPLC)。级分然后用以系列的组合稀释。所述系列组合稀释要求至少两种级分来开始。优选地，将生物分子的复杂混合物分级为尽可能多的级分，以允许在接着的检测步骤中检测和鉴定足够数量的不同目标生物分子。优选地，初始级分的数目不是素数，更优选地初始级分的数目是偶数，并且优选地，每一初始级分包含至少一种不同的组分。用来开始系列组合稀释的级分的数目取决于生物分子混合物的复杂度，取决于生物分子复杂混合物中的单个生物分子的浓度、分离方法的效率，以及取决于分级和系列组合稀释后使用的检测和鉴定方法。对于系列组合稀释，将至少两种不同的包含至少一种不同生物分子的级分进行合并。优选地，合并两种级分。这将改变合并的级分中生物分子的浓度，所述合并级分中生物分子的浓度为将每一级分中生物分子浓度与每一级分的体积相乘所获得的点值除以所有合并级分总体积的比值。一般的，和初始级分中的各个生物分子的最大浓度相比较，这将导致稀释的级分中任何生物分子组分的更小浓度。在下面的稀释步骤中，将单个蛋白质的浓度降低至低于接着进行的检测和鉴定方法的灵敏度阈。稀释步骤的数目取决于初始级分中生物分子的起始浓度、分级后初始级分的数目以及检测和鉴定方法的检测限。本专利技术方法还包括检测和鉴定方法。检测方法必须描述明确的灵敏度阈和提供关于被检测生物分子的鉴定信息。因此，可确定初始级分或稀释的级分中特定生物分子的存在或不存在。本专利技术的检测和鉴定方法可以依赖生物分子的化学组成、结构，或序列以及由此产生的物理-化学或酶促特性。这些包括使用特定探针的杂交、与特定抗体或凝集素反应、和特定分子探针的酶促或化学反应、等电点、分子量、从生物分子的酶消化物中产生的片断的分子质量、NMR谱或它们的组合。以蛋白质定量为例，本专利技术的检测和鉴定方法可以选自单向或双向凝胶电泳和质谱的组合、免疫检测法(例如western印迹法)、气相色谱/质谱联用法(GS/MS)、或使用特定标记分子例如荧光标记、化学标记(例如生物素)或放射性标记的电泳法的这类方法。为了得到生物分子的定量，对每一稀释步骤的级分的鉴定或特定指纹谱(肽质量指纹谱)进行了计算，其中考虑了每个稀释步骤各自的稀释因子。得到的生物分子的鉴定数目在全部稀释水平上得以加和。为了归一化，可以用这个总数处以全部级分(初始级分和稀释级分)中的全部生物分子的鉴定总数目。相对量(q)=Σ(di×Ni)Ntotal]]>其中Ni是稀释水平i上的单种生物分子的鉴定数目N，di是各个稀释水平i的稀释因子d，以及Ntotal是全部稀释水平上全部级分中全部生物分子的鉴定总数目N。本专利技术与不同生物分子的特性无关。对多核苷酸和多肽或碳水化合物均同样可定量。本专利技术的其它优势是它以简单的方式将定量和鉴定结合而不需要针对生物分子定量进行额外努力。而且，如果需要将来自一种来源的生物分子的量与来自另一来源的生物分子的量进行比较，则可对生物分子混合物相互独立地处理。现在已经一般地描述了本专利技术，通过参考具体的实施例及下列附图将能更好地理解本专利技术，其中所述的具体实施例除非另有说明在此仅是为了阐述的目的而不用于限制本专利技术。附图说明图1说明了本专利技术的方法在第一步中将复杂混合物分级成不同级分。然后将这些级分进行系列组合稀释。在第二步中对样品库用例如双向凝胶电泳法和随后的质谱法鉴定检测生物分子。(AU吸收单位；8到23级分)图2展示了生物分子的相对量的计算。q生物分子的相对量；Ni稀释水平i上单个生物分子的鉴定数目N；di各个稀释水平i的稀释因子d；Ntotal全部稀释水平上所有级分中的所有生物分子的鉴定总数目N。(图解N1未稀释，N22倍稀释，N34倍稀释，N48倍稀释)图3显示了在双向凝胶电泳中从水平1(未稀释)、水平2(2倍稀释)、水平3(4倍稀释)和水平4(8倍稀释)上对糖蛋白磷酸化酶(a)，波形蛋白和热休克蛋白105(c)的鉴定的数目。从重复三次进行的试验加和值。(对照5mM葡萄糖；高葡萄糖10mM)实施例除非另外指出，实施例中涉及的市售试剂根据生产商指导手册使用。实施例1细胞培养将INS-1细胞(Asfari，Janjic等，1992)培养于补充有10％FCS(Invitrogen，热灭活)、10mM Hepes溶液(Invitrogen)、1mM丙酮酸钠(Sigma)、50μM β-巯基乙醇(Sigma)、1％青霉素/链霉素溶液(SIGMA)和低(5mM)或高(10mM)浓度葡萄糖(本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于在生物分子的复杂混合物中定量生物分子的方法，所述方法包括：ａ．提供来自于对生物分子的混合物进行分级获得的至少两种级分，其中所述每一级分包含至少一种不同的组分，ｂ．将所述级分进行系列组合稀释，ｃ．通过提供灵敏度阈和鉴定信息的方法检测和鉴定在每一初始级分和每一稀释级分中的生物分子，以及ｄ．通过考虑各自的稀释因子，加和每一稀释水平上每一级分中生物分子的鉴定数目，从而定量复杂混合物中的生物分子。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：P伯恩特，S埃弗斯，H朗根，
申请(专利权)人：弗哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[]