本发明专利技术涉及基于抗原－抗体相互作用的生物聚合物检测方法，其中该方法显示出提高了的Ｓ／Ｎ比率、提高了的检测灵敏度和减少了的检测时间。本发明专利技术还涉及这些方法在生物芯片上的应用。本发明专利技术还涉及抗体固定方法，其中抗体分子被固定到含有酰胺基团的凝胶、或不溶性物质上的含有酰胺基团的凝胶上。使用这样的凝胶防止了抗体结合分子的非特异性吸附。通过将这些抗体结合分子包埋在这样的凝胶中，防止了它们的抗体结合活性的退化。通过将靶生物聚合物捕获到基质面来检测生物聚合物的方法，包括以下步骤：（１）将靶生物聚合物，连同探针生物聚合物和由抗体或地址探针肽或连结于它们的表面的生物聚合物地址接头所识别的珠一起，置入溶液中；（２）使靶生物聚合物与探针生物聚合物杂交；以及（３）通过抗原－抗体相互作用、通过地址探针肽或生物聚合物或多克隆抗体分子来识别结合到基质上的地址接头。固定抗体的方法包括以下步骤：（１）在二或三维空间中将用抗体结合分子包埋的含有酰胺基团的凝胶施加在不溶性物质的基质上；和（２）将抗体分子的基部附着到抗体结合分子上。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术描述了检测生物聚合物如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和蛋白质的方法；以及使用这些方法的生物芯片。此外，本专利技术涉及固定抗体的方法，以及其上固定抗体的基质。
技术介绍
通过使用微点阵(microarray)检测生物聚合物(在下文中以DNA作为例子)的技术是公知的，例如在未审的公开的日本专利申请No.(JP-A)2000-131237中所描述的那种技术。这些类型的DNA微点阵通常按如下所述来形成和用于检测DNA将含有与靶mRNA(或cDNA)互补的序列的DNA探针的阵列(arrays)点样(spot)并随后固定在玻璃(或塑料)基质(substrate)上。使该基质与溶液中的一组荧光标记的靶mRNA(或cDNA)接触。此时，互补探针与靶mRNA(或cDNA)杂交并结合形成复合物。其序列不与探针互补的那些靶不发生杂交。当已充分进行杂交时，用缓冲液清洗基质的表面，洗掉任何未结合的靶分子。靶mRNA(或cDNA)的存在或不存在，以及它们的量，可以从杂交所处的样斑处的荧光强度来光学测定。这样的光学测定方法已是很成熟的，并在JP-A2000-235035中详细描述了一个这样的例子。传统的DNA微点阵方案的使用，例如以上所描述的那一方案未能提供满意的结果。每种方案中的每一步骤都造成许多问题，包括数据的精确性、再现性(reproducibility)、可重复性(repeatability)和灵敏性，这妨碍了实验数据的标准化。除了靶cDNA选择中的困难即疾病内容序列选择(diseasecontents sequence selection)的困难外，这些问题阻碍了DNA微点阵技术成功进入临床应用。在解决上述问题中，根本的是改善S/N比率、检测灵敏度、检测时间、数据精确度，以及再现性。专利技术概述本专利技术意在解决上述问题。具体地，本专利技术的一个目的是提供一种基于抗原-抗体相互作用和珠技术的检测生物聚合物的方法，以改善S/N比率和检测灵敏度，以及缩短检测时间。本专利技术的另一个目的是提供用于所专利技术的方法中的生物芯片。附图说明图1是本专利技术检测生物聚合物的方法实例的原理的示意图。图2是本专利技术中检测生物聚合物的方法实例的原理的第二示意图。图3是本专利技术中检测生物聚合物的方法实例的原理的第三示意图。图4是本专利技术的另一个实施例的、固定抗体分子的方法的原理的示意图。图5是说明抗体分子是如何被固定到聚丙烯酰胺凝胶基质上的示意图。专利技术详述在本专利技术中，组合了珠和DNA微点阵技术的优点。珠比平板提供了更大的表面积(每体积)，因此允许结合更多的探针DNA。另外，增加了探针DNA与靶分子之间的碰撞频率，这是由于与平板相比在溶液中的珠具有增大了的移动性。因此，溶液中的靶DNA捕获的灵敏性提高了。作为缺点，需要鉴别在其上结合了探针DNA的个别珠。已试用各种技术，如使用彩色珠和两色光源，来解决此问题。然而，能成功鉴别的珠的数目仍然较小，设备变得更复杂、更昂贵、更大和更难以操作。本专利技术通过利用在固定在珠上的肽抗原与固定在阵列中的抗体(反之亦然)之间发生的抗原-抗体相互作用提供了这些问题的完美的解决方案。以下参照图1至3详细地描述本专利技术。图1至3是说明本专利技术的检测生物聚合物的方法的示意图。请注意，在这里这些解释针对DNA生物聚合物。如图1中所示，探针DNA(2)被固定到珠(1)的表面。所述珠可以是，例如，磁性的、金属的、和/或塑料的。地址接头(address linker)(3)被连结到珠(1)的表面上以能实现珠的鉴别信息(ID)的识别。地址接头(3)可以是抗原或(单克隆或多克隆)抗体。荧光标记(5)用于标记靶(4)，靶(4)可以是RNA、cDNA、或蛋白质(在下文中这些以“RNA”代表)。珠(1)和靶RNA(4)如上所述制备，根据需要通过物理或电的方法混合在容器(7)中的缓冲液(6)中。结果，靶RNA(4)结合到通过互补碱基配对固定在珠(1)表面的探针DNA(2)上。然后将携带着前述复合物的珠与图2中所示生物芯片基质(10)上部位(11)的阵列一起保温。图2A和图2B分别显示生物芯片的侧视图和平面图。地址探针蛋白(12)，如抗原或抗体，被预固定到部位(11)上以通过抗原-抗体相互作用来捕获固定在珠(1)表面的ID-识别型地址接头(3)。请注意，图3是在图2中圈出的区域A的放大图。地址接头(3)通过抗原-抗体相互作用结合到地址探针蛋白(12)上。荧光标记(5)可用于鉴别探针部位(11)中的哪个地址探针蛋白(12)已结合到珠(1)上。使用荧光读出器(未示出)可以容易地检测荧光标记。因此，可以有效地测定靶RNA(4)的存在和量。例如，除了多克隆抗体，地址探针肽或生物聚合物也可以用做地址接头。在这种情况下，一种地址探针肽、生物聚合物或多克隆抗体被固定到基质上，其每一种都与一种特异性地址接头具有抗原-抗体关系。本专利技术包括下列优点(1)可以固定大量的探针DNA，因为珠具有相当大的表面积与体积的比率。因此，可以以非常高的灵敏度捕获溶液中的痕量的靶聚合物。(2)每个珠上增加了量的探针DNA可与更多靶DNA杂交，从而可提高S/N比率。(3)由于珠的移动性，探针DNA和靶DNA相互间的碰撞机会增加了。因此，缩短了检测时间(主要是杂交所需要的时间)，并且靶DNA与探针DNA之间的杂交会非常灵敏。下列具体实施方案描述了固定抗体的方法，以及在其上固定抗体的基质，其中这些方法可以用于以上所述的检测生物聚合物的方法，并可用于应用这些检测方法的生物芯片。如上述实施例所说明的，抗体结合分子可特异性地结合到特异性抗原分子上。这些抗体通常在被固定到不溶性基质如塑料或金属(相当于上述实施例的基质)之后被使用。大多数这些不溶性物质非特异性地吸附生物聚合物。将抗体分子固定到不溶性物质上的一种方法是通过利用被固定到该不溶性物质上的抗体结合分子。在这种情况下，通过共价键或通过非共价键如静电相互作用将抗体结合分子固定到不溶性物质上。例如，在JP-A2001-147229中描述了这种方法。然而，传统方法具有以下缺点(1)由于不溶性物质非特异性地吸附生物聚合物，可能会妨碍免疫测定、分级分离和纯化。(2)由于不溶性物质和抗体结合分子之间的第二(非特异性的)相互作用，分子会失去抗体结合能力；当抗体结合分子被放置得与不溶性物质极其近时就会发生所述的第二(非特异性的)相互作用。下列实施例通过使用含有酰胺基团的凝胶来防止抗体结合分子的非特异性吸附，以及通过将抗体结合分子包埋到该含有酰胺基团的凝胶中来防止抗体结合活性的退化，解决了这些问题。这样，在本专利技术中，抗体分子被固定到含有酰胺基团的凝胶上或固定到在不溶性物质上的含有酰胺基团的凝胶上。在这一实施例中，本专利技术使用聚丙烯酰胺凝胶作为基质材料。另外，以这样的方式制备基质以使得抗体结合分子被包埋到聚丙烯酰胺凝胶中，并且通过与该凝胶中的酰胺基团载体的结合可以防止它们的抗体结合活性的退化。本专利技术的这一实施例还包括下列特征由于抗体结合分子被包埋在聚丙烯酰胺凝胶中，它们的抗体结合活性不会因与载体的结合而退化。通过将抗体结合分子引入到凝胶中，这些分子保持在一种接近于溶液中的状态，此状态中它们是功能上活跃的。此外，通过包埋进行的固定化不依赖于抗体结合分子的官能团，而本文档来自技高网...
【技术保护点】
通过将靶生物聚合物捕获到基质面（ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｉｄｅ）来检测生物聚合物的方法，该方法包括以下步骤：ａ）添加荧光标记的靶生物聚合物和珠，其中探针生物聚合物和特异于所述珠的ＩＤ的地址接头被固定在溶液中所述珠的表面（该地址接头可以是抗体、肽或其他生物聚合物）；ｂ）使所述靶生物聚合物与所述探针生物聚合物杂交；和ｃ）利用固定在基质上并与所述地址接头有抗原－抗体关系的地址探针肽、生物聚合物或抗体，通过抗原－抗体相互作用捕获所述的地址接头。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：嶋本伸雄，须佐太树，福岛和久，
申请(专利权)人：情报系统研究机构，横河电机株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]
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