检查和制造降低了粒子形成能力的(-)链RNA载体的方法技术

本发明专利技术提供测试及制备粒子形成能力已被降低或消除的（－）链ＲＮＡ病毒的方法。表明导入了这种（－）链ＲＮＡ病毒载体的细胞中Ｍ蛋白定位的缺陷会抑制该细胞中病毒样粒子（ＶＬＰ）形成。本发明专利技术提供测试及筛选病毒粒子形成能力已被降低或消除的（－）链ＲＮＡ病毒载体的方法，以及制备粒子形成能力已被降低或消除的（－）链ＲＮＡ病毒载体的方法。由于该载体在导入细胞中既不产生细胞毒性又不会引发病毒二次释放所带来的免疫反应，这种ＶＬＰ形成能力已被降低或消除的载体可以用于基因治疗。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检查和制造(-)链RNA病毒载体的方法，所述载体的粒子形成能力已被降低或消除。
技术介绍
近年来，(-)链RNA病毒如仙台病毒(Sendai virus)(SeV)的遗传重组技术的发展已使其可作为基因转移载体用于更广泛应用(WO00/70055和WO00/70070)。但是，这些载体都有一个问题，就是载体导入后，病毒从靶细胞中二次释放。病毒粒子在被复制型病毒感染的细胞内形成，然后释放出子代病毒。还发现病毒样粒子(VLP)可以从导入了F缺陷型非复制型SeV的细胞释放。这样，非常渴望发展出一种不生产VLP的表达载体。
技术实现思路
本专利技术提供检查和制造(-)链RNA病毒载体的方法，所述载体的粒子形成能力已被减弱或消除。已经报道基质(M)蛋白对于仙台病毒(SeV)和其它(-)链RNA病毒中病毒粒子的形成起关键作用。例如，已经发现水泡性口炎病毒(VSV)中M蛋白的过表达会导致VLP出芽(budding)(Justice，P.A.等，J.Virol.69；3156-3160(1995))。还有报道称副流感病毒VLP的形成也在仅仅有M蛋白过表达的情况下发生(Coronel，E.C.等，J.Virol.73；7035-7038(1999))。虽然这种由M蛋白单独引起的VLP形成并不能在所有的(-)链RNA病毒内观察到，但M蛋白可作为病毒粒子形成的核心来识别，就这一点而言所有(-)链RNA病毒均一致(Garoff，H等，Microbiol.Mol.Biol.Rev.621171-1190(1998))。M蛋白对病毒粒子形成的特定作用归纳如下病毒粒子是在细胞膜中所谓的脂筏(lipid raft)上形成的(Simons，K和Ikonen，E.Nature 387；569-572(1997))。这些起初是被鉴定为不溶于非离子型去污剂(如TritonX-100)的脂类组份(Brown，D.A.和Rose，J.K.Cell 68；533-544(1992))。病毒粒子在脂筏上的形成已在流感病毒(Ali，A等，J.Virol.74；8709-8719(2000))，麻疹病毒(MeV；Manie，S.N.等，J.Virol.74；305-311(2000))，SeV(Ali A和Nayak，D.P.Virology 276；289-303(2000))以及其它病毒中证实。在这些脂筏位点上，M蛋白能够促进病毒粒子的形成，浓缩包膜蛋白(也称为刺突蛋白(spike protein))和核糖核蛋白(RNP)。换言之，M蛋白能够驱动病毒组装及出芽(Cathomen，T等，EMBO J.17；3899-3908(1998)，Mebatsion，T.等，J.Virol.73242-250(1999))。事实上，已经发现M蛋白能够结合流感病毒(Zhang，J等，J.Virol.67；651-663(1993))和SeV(Sanderson，C.M等，J.Virol.74；651-663(1993))刺突蛋白的细胞质内尾巴(cytoplasmic tail)等。它还可结合流感病毒(Ruigrok，R.W等，Virology 173；311-316(1989))，副流感病毒，SeV(Coronel，E.C.等，J.Virol.75；1117-1123(2001))等的RNP。另外，已经报道M蛋白在SeV(Heggeness，M.H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79；6232-6236(1982)和水泡性口炎病毒等(VSV；Gaudin，Y.等，Virology 206；28-37(1995)，Gaudin，Y.等，J.Mol.Biol.274；816-825(1997))中可以与自身形成寡聚物。这样，根据这些病毒组份结合脂类的能力，M蛋白可以作为病毒组装和出芽的驱动力量。基于这些发现，本专利技术人认为应该重点研究M蛋白的修饰，以抑制粒子(VLP)的二次释放。另外，一些报告显示对包膜蛋白(刺突蛋白)进行修饰也可以抑制VLP释放。下述试验性实施例是病毒粒子的形成被确实抑制的具体报告狂犬病病毒(RV)中G蛋白缺陷导致VLP形成降低1/30(Mebatsion，T.等，Cell 84；941-951(1996))。当M蛋白缺陷时，该水平下降至1/500,000或更低(Mebatsion，T等，J.Virol.73；242-250(1999))。另外，在麻疹病毒(MeV)的例子中，当M蛋白缺陷时，细胞与细胞的融合会提高(Cathomen，T.等，EMBO J.17；3899-3908(1998))。可以假设这是由于病毒粒子的形成被抑制而导致。另外，当F或H蛋白的细胞质内尾巴(在细胞质一侧的尾巴)中存在突变时也会出现类似的融合提高现象(Cathomen，T等，J.Virol.72；1224-1234(1998))。具体而言，已经阐明了SeV的下述问题当SeV蛋白F和HN处于分泌途径中时(具体为当它们位于高尔基体等时)，(F或HN蛋白的)细胞质内尾巴会结合M蛋白(Sanderson，C.M.等，J.Virol.67；651-663(1993)，Sanderson，C.M.等，J.Virol.68；69-76(1994))。本专利技术的专利技术人假定该结合对于M蛋白有效转移到细胞膜脂筏上的过程至关重要，而病毒粒子正是在脂筏上形成。M蛋白被认为可以结合细胞质内的F和HN蛋白，然后就可以通过F和HN蛋白分泌途径转移到细胞膜上。本专利技术的专利技术人认为缺失这种“核心”M蛋白应该是进行修饰以抑制二次粒子释放即VLP释放的最有效途径。但是，如果该修饰病毒在工业规模应用，例如用于基因治疗，那么必须考虑该病毒的生产过程。如上所述，使用此前报道的RV和MeV体系——即由痘苗病毒(VV)-驱动的T7聚合酶诱导表达的体系(Mebatsion，T等，J.Virol.73242-250(1999)；Cathomen，T等，EMBO J.17；3899-3908(1998))——很难获得高滴度的病毒。用于诱导表达的VV会不可避免地污染制备的M缺陷病毒溶液。这样，很难生产事实上可应用的病毒。除了M蛋白缺失方法之外的有效方法包括缺失F和HN蛋白，F和HN蛋白被认为在M蛋白向细胞膜脂筏上转移的过程中起作用；或者导入突变以便仅仅使这些蛋白的细胞质内尾巴缺失的方法。但是，一些报告描述了许多VLP的存在，特别是在F缺陷型(WO 00/70070)和HN-缺陷型SeV(Stricker，R.和Roux，L.，J.Gen.Virol.72；1703-1707(1991))的情况中。于是认为该方法并非行之有效的方法。目前为止，除了细胞质内尾巴之外，没有鉴定出预期能够影响VLP形成的刺突蛋白区域。同样，也没有鉴定出预期能够影响VLP形成的M蛋白区域。另外，仍需考虑适于工业应用的病毒制备，这类过程的设计难度颇大。为解决VLP释放被抑制的载体的构建问题，本专利技术人考虑在病毒基因中使用温度敏感突变。已经报告了能够在低温而不能在高温下生长的突变病毒株。本专利技术人设想，在高温下抑制病毒粒子形成的突变蛋白，特别是突变M或蛋白，可以通过下述方式用于抑制VLP形成可以在低温下(例如32℃)进行病毒的生成本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检查（－）链ＲＮＡ病毒载体的粒子形成能力的方法，其中该方法包括检测Ｍ蛋白在导入了该载体的细胞中的定位。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：井上诚，德炭由美子，饭田章博，长谷川护，
申请(专利权)人：株式会社载体研究所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]