检测瘦素受体配体的方法技术

本发明专利技术涉及用于检测瘦素受体配体与在包含瘦素受体和能量供体蛋白的融合蛋白及包含瘦素受体和能量受体蛋白的融合蛋白之间进行的能量转移间的关系的方法。本发明专利技术还涉及融合蛋白在所述方法中的应用。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及利用在由瘦素(Reptin)受体和能量供体或能量受体蛋白质组成的融合蛋白之间的能量转移来检测瘦素受体的方法。本专利技术也涉及实施本方法的融合蛋白。瘦素受体是分子量为16kDa的蛋白质，由脂肪细胞分泌。该蛋白质与饱满感有关，且在控制体重、能量消耗、骨形成和血管生成中发挥重要作用，也发挥其它生理功能，如引发青春期和控制生殖、或者调节T淋巴细胞介导的免疫反应。瘦素受体(OBR)属于细胞因子受体家族。如附图说明图1所示，它由包含跨膜结构域(Tartaglia等，J.Biol.Chem，272，6093-6096，1995)的单一多肽链组成。专利申请WO97/19952涉及该受体。6种具有不同长度的C末端结构域的不同同工型的OBR得到了描述。这些同工型都来源于单一基因的备选剪接。也存在可溶形式的OBR，它含有与膜结合型的胞外结构域对应的瘦素结合位点。该可溶型发现于血液中，由膜结合型在质膜通过蛋白质水解作用的翻译后产生。另一可溶型的OBR是由于在跨膜结构域之前出现终止密码子而产生的突变，发现该可溶型是很少见的情况。Lundin等(Biochemica and Biophysica Acta，1499，130-138，2000)已用由长型瘦素受体(OBRl)融合至EGFP(增强的绿色荧光蛋白)组成的融合蛋白来研究该受体的定位。OBR的激活认为是通过由2个Janus激酶2(JAK2)和2个OBR的四聚体复合体而产生的。瘦素诱导的受体激活将诱导OBR的构象变化，这将使它激活一个JAK2，接下来磷酸根转移活化另一个JAK2，然后是OBR受体。OBR的激活似乎是形成所有瘦素已知效应的原因，如体重丧失、以及所有涉及体重紊乱的现象。关于骨合成中瘦素的抑制特性最近因此得到证明。瘦素通过抑制成骨细胞的活性发挥作用，而这些细胞与骨的形成有关。修饰leptinemia也许使它可治疗与骨密度下降相关的疾病，如骨质疏松症、或者相反地治疗那些与严重的钙化作用相关的疾病。在1999年，Xu等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，151-156)描述了一种在活细胞中检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法。该方法也是专利申请WO 99/66324的主题。该方法也称为BRET(生物发光共振能量转移)，它依据一种自然现象，即海洋生物体发出荧光。由Renilla萤光素酶(Luc)介导的可跨膜底物的酶促转换可产生生物荧光，这将依次刺激能量受体，如黄色荧光蛋白质(YFP)。该方法对应于Wang等(Mol.Gen.Genet.264578-587(2001))所述的LRET(发光共振能量转移)。能量转移的效率取决于物理接近性以及分别的受体和供体的方向。因此，萤光素酶和YFP的共表达不足以诱导能量转移，因为这两种蛋白质之间的距离必须小于100。为研究两种潜在相互作用蛋白质之间的相互作用，将第一种蛋白质融合至萤光素酶，将第二种蛋白质融合至YFP。如果两种蛋白质相互作用，就会观察到能量转移。从那以后，已将BRET方法用于具有不同于瘦素受体结构的有限数量的受体。因此，一些作者描述了在G蛋白偶联受体(GPCR)家族，如β2-肾上腺素能受体(Angers等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 10，1073)，cholesystocine型A受体(CCK，Cheng等，2001，Biol.Chem.27648040-48047)和促甲状腺素释放激素受体(Kroeger等，2001，J.Biol.Chem.27612736-12743)中使用该方法。这些受体体积大，显示为包含7个跨膜结构域的复合体。最后，Boute等(2001，Mol.Pharmacol.60640-645)描述了下述利用BRET激活胰岛素受体方法。胰岛素受体由共价的二聚体组成，而不是如瘦素受体那样的非共价复合体。另外，它包含长的胞内部分。最后，由胰岛素诱导的BRET改变仅可在可溶性受体上实现。几十年来，肥胖症已成为工业化国家主要的公共健康问题，在这些国家，20-30％的人群受到影响。在未来的时间，这些数字将令人担忧地进一步增加。肥胖症构成了对药物的真正挑战，这是由于多因素引起的，其中所述多因素或多或少地源于第一是环境因素(饮食特点、接近食物、能量消费等)，第二是多样的遗传原因。同样地，骨疾病如骨质疏松症逐渐影响大量人群。因此治疗多种与瘦素受体相关的疾病的新型分子的发现，其中所述疾病如肥胖症和骨质疏松症，代表对公共健康的高度重视。然而，没有用于高通量特异性筛选瘦素受体激动剂或拮抗剂的方法存在。因此，本申请人努力实现快速、特异和有效的用于瘦素受体激动剂或拮抗剂的筛选试验。令人惊讶的是，他们已表明，瘦素受体诱导的BRET改变可用于一种同工型的瘦素受体，但不能在所有同工型中实现。他们也表明，在瘦素受体上实现BRET在某些操作条件下是最佳的。因此，本专利技术涉及，所述方法利用由瘦素受体或瘦素受体的实质性部分、和能量供体蛋白质或能量供体蛋白质的实质性和活性部分组成的第一融合蛋白以及由瘦素受体或瘦素受体的实质性部分、和能量受体蛋白质或能量受体蛋白质的实质性和活性部分组成的第二融合蛋白之间的共振能量转移。本专利技术也涉及实施所述方法的融合蛋白，也涉及编码这些蛋白质的核酸。本专利技术的一个主题也是一种用于治疗或预防与瘦素相关的疾病的方法，包括给患有上述疾病的病人施用用上述方法选择的配体。因此，本专利技术的第一个主题是由瘦素受体或瘦素受体实质性部分、和能量受体或供体蛋白质或能量受体或供体蛋白质的实质性和活性部分组成的融合蛋白。根据本专利技术，融合蛋白本质上由相应于所有或部分瘦素受体序列的部分、和相应于能量供体或受体蛋白质的部分组成。然而，它们可包含其它蛋白质的其它氨基酸序列，如信号序列。因此，SEQ ID No.4的序列由SEQID No.2的一部分和其它序列，特别是小鼠白细胞介素3的信号序列组成。有利地，能量供体蛋白质是Renilla萤光素酶。然而它可能是任一其它能量供体蛋白质，这样供体的发射光谱充分地与受体的激发光谱重叠，以允许在这两部分之间进行高效的能量转移。因此，如果能量转移是FRET，它可是GFP，或者如果能量转移是CRET，它可是水母发光蛋白。水母发光蛋白可以得到，并按专利申请EP0187519或者Inouye等的文章(PNASUSA 823154-3158(1985))中所述进行使用。关于能量受体荧光蛋白质，优选的是DsRed或者GFP或者该蛋白质的突变体，如YFP、EYFP、野生型GFP、GFPS65T或者Topaz。然而，它可能是任何其它能量受体荧光蛋白质，只要受体的激发光谱和供体的发射光谱充分重叠，以至于可允许在这两部分之间进行高效的能量转移。这些蛋白质已为本领域技术人员熟知，可在文献中找到这些蛋白质的序列，特别是Blinks等的综述(Pharmacol.Rev.281-93(1976))。特别是，Tsien(Annu.Rev.Biochem.67509-544(1998))描述了GFP，Prasher等(Gene 111229-233(1992))描述了它的克隆。关于DsRed的克隆，Matz等(Nat.Biotechnol.17969-973(1999))进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合蛋白，其特征在于由具有短胞内结构域的瘦素受体、或这种受体的含有瘦素结合位点的可溶形式、或这种瘦素受体的实质性部分、和能量供体或能量受体蛋白质、或能量供体或能量受体蛋白质的实质性和活性部分组成。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：R约克斯，C库蒂里耶，
申请(专利权)人：安万特医药股份有限公司，健康和医学国家研究院，科学研究国家中心，
类型：发明
国别省市：FR[法国]