通过毛细管电泳和免疫位移对单克隆蛋白进行分析和分型制造技术

本发明专利技术涉及对生物样品进行毛细管电泳分析的方法，包括采用带有超额负电荷的修饰抗体，当在电泳过程中分离生物样品中的蛋白质时，所述修饰抗体可以迁移至所述蛋白质的迁移区域之外的区域，所述抗体具有针对预定靶蛋白的抗原特异性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及通过毛细管电泳和免疫位移分析生物样品的领域。本专利技术特别涉及通过毛细管电泳分析生物样品的方法，其中用免疫技术对样品进行处理，从而对样品的组分进行电泳分离。在本专利技术中，术语“免疫扣除”是指抑制特定蛋白在电泳图谱中的峰，其是由于所述蛋白的峰发生免疫位移导致，即位移至图谱中的另一位置。尤其是，本专利技术涉及可以用于诊断过程的方法，特别涉及对生物样品中的蛋白进行研究和分型，其能证明存在有单克隆疾病，也就是公知的单克隆丙种球蛋白血症(gamma pathies)或异型蛋白血症。B淋巴细胞的正常发育使得在成熟B淋巴细胞的表面产生开始时具有相同的同种型的同种型M和G免疫球蛋白。在单克隆疾病初期的浆细胞疾病是由于当表面免疫球蛋白暴露于特定抗原后对发展至抗体分泌细胞的细胞成熟过程的控制存在缺陷。在这种情况下，当抗原消失时，继续分泌对宿主所暴露的抗原具有亲合力的免疫球蛋白。通常，特定种属的免疫球蛋白分为不同类型的抗体，每种类型用一种同种型确定，在该种属内所确定的不同同种型是该种属的所有正常个体所共有的。免疫球蛋白通常由重链(2个重链)和轻链(2个轻链)构成。已经在具有四个链的结构中确认了五种重链同种型(M，G，A，D，E)和两种轻链同种型(κ和λ)。除了这些同种型之外，免疫球蛋白还通过决定子表征，所述决定子对应于给定种属的个体之间的差异，称为同种异型，还可以通过它们的个体基因型表征，其对应于免疫球蛋白分子与抗原结合的部分。这样，所述个体基因型表示了由特定的产生抗体的细胞系所生成的分子的特征。因此，浆细胞疾病的特征是特定免疫球蛋白或特定免疫球蛋白链的改变，检测和表征所述改变具有非常重要的临床意义。生物样品的电泳分析允许对丝胶(seric)蛋白质进行鉴别，并确定这些蛋白质的量，尤其是免疫球蛋白的量。在电场中，蛋白质的迁移是其大小和电荷的函数，形成包括一系列峰(也称为级分)的电泳图谱，每个峰对应一个或多个蛋白质。γ级分特别是由免疫球蛋白形成的，主要是G型免疫球蛋白。在患有分泌单克隆蛋白质(也称为“Mc蛋白质”)的浆细胞疾病的患者中，对应于一种已知同种型的免疫球蛋白的量可以显著高于正常的量，其导致了从血清样品分离出的一个或多个蛋白质峰发生改变，从而使电泳图谱发生改变。当研究浆细胞疾病以及监测患有异型蛋白血症的患者时，检测单克隆蛋白质特别是检测特定免疫球蛋白同种型生成量的增加具有重大意义。例如，人们已经观察到，根据特定病例特别是在肿瘤发展中，丝胶Mc蛋白质的量与疾病的发展直接相关。因此，Mc蛋白质可以作为肿瘤标记物，当与其它症状相联系时，在诊断时可以考虑Mc蛋白质。浆细胞疾病不仅与Mc蛋白质的异常生成有关；与Mc蛋白质的生成有关的疾病包括淋巴瘤，例如慢性淋巴性白血病或B或T淋巴细胞系的淋巴瘤，某些非淋巴细胞的增殖，例如慢性髓细胞性白血病，以及乳腺癌或结肠癌。单克隆Mc蛋白质还可以在特定的非恶性疾病中生成，例如肝硬变(cyrrhosis)、伯克氏肉样瘤、寄生虫病或Gaucher病。单克隆蛋白质的生成还可以在自身免疫性疾病中检测出，例如类风湿多发性关节炎、肌无力或冷凝集素病。由于能够检测出生物样品中单克隆蛋白质的存在以及能够发现随着时间被检测的单克隆蛋白质的变化，琼脂糖凝胶以及毛细管电泳成为进行诊断或监测患者的可选择方法。根据有关的疾病，Mc蛋白质具有不同的性质，由完整的抗体分子或抗体片段构成。这样，可以单独生成重链或轻链。例如在患有骨髓瘤的患者尿中分泌的本斯·琼斯氏蛋白仅仅为轻链形式。确定免疫球蛋白的同种型使得Mc蛋白质作为其重链性质的函数和/或轻链性质的函数而进行分型。对免疫球蛋白进行分型的技术可以确定生物样品中每个单克隆蛋白质相关的重链和/或轻链类型。除了检测所述Mc蛋白质之外，对所述蛋白质进行分型从而对与其相关的疾病进行表征也是非常重要的。为了达到该目的，已经提出了不同的方法，例如柱色谱、琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳。在采用琼脂糖凝胶电泳的方法中，来自生物样品的蛋白通过电泳以电泳图谱的形式进行分离，在所述图谱中，蛋白质特别是球蛋白以峰或带的形式显示，其中可以包括单克隆蛋白质，单克隆蛋白质的性质例如通过免疫固定于琼脂糖凝胶上来确定。所述方法包括两个步骤，即琼脂糖凝胶电泳和免疫沉淀。将相同生物样品的几个等分试样平行沉积于琼脂糖凝胶上，然后施加电场以分离蛋白尤其是免疫球蛋白。每个泳道用对所研究的免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM，κ和λ，可以是游离κ，游离λ，IgD以及IgE)具有特异性的抗体类型进行温育，从而在样品的免疫球蛋白和抗体之间形成免疫复合物。洗净凝胶以去除未沉淀的蛋白之后，进行染色，其显示了免疫复合物的位置当不存在单克隆蛋白质时，只显示被染色的扩散背景(对应于构成“多克隆背景”的多个单克隆蛋白质)；当存在单克隆蛋白质时，在凝胶的特定区域显示染色带。采用参照泳道(没有抗血清)，就可以对凝胶上可见的每个单克隆带进行分型。在毛细管电泳中采用的一种分型技术是免疫扣除，如美国专利US-A-5228960中所述。所述技术包括用特定抗体对生物样品的等分试样进行温育，所述特定抗体可以从所述样品中扣除特定组分(例如免疫球蛋白)。所述组分吸附于其上固定有抗体的固相从而其不再存在于通过毛细管电泳进行分析的样品中。然后将经处理的不同等分试样(其中根据所使用的抗体的特异性除去了特定的免疫球蛋白)注入毛细管中，在毛细管的端部施加电场从而分离出等分试样中含有的蛋白质。所获得的图谱与未处理的等分试样的图谱进行比较。人们还提出了其它对通过毛细管电泳从样品中分离出的单克隆蛋白质进行鉴别的技术，例如欧洲专利EP-B1-0690988。该欧洲专利描述了毛细管电泳分离与免疫扣除步骤的结合，其目的是有利于Mc蛋白质的分类。在该专利中，免疫扣除在“毛细管上”进行，其采用的方法包括将样品的第一部分通过电泳分离成不同的组分，检测这些组分，然后混合所述样品的第二部分和至少一个配对物质，所述配对物质能够特异结合样品中含有的预定分析物，应该理解，所述用于结合的特定配对物质的电泳迁移率不同于所述分析物。所述样品的第二部分通过毛细管电泳被分离成不同的组分，检测这些组分。然后对所分离出的组分与在不存在结合所需要的分析物的特定配对物质而得到的组分进行比较。EP-B1-0690988描述了用于结合分析物的配对物质为经修饰的分子，尤其是抗Mc蛋白质的抗体，其经过了化学修饰，从而其在毛细管电泳中的迁移时间使其位于电泳图谱中的γ区域之外。所提出的对抗体进行的一种化学修饰是使抗体与琥珀酸酐反应使其具有额外的羧基官能团，其在碱性pH条件下带负电荷。在所描述的分析条件下(pH10)，所述抗体的总负电荷增加了。在研究“真正”生物样品例如血清中的单克隆蛋白质时，EP-B1-0690988中描述的对抗体进行修饰的条件以及所报道的试验结果仅仅涉及经纯化的G型免疫球蛋白的分析和分离，而不是血清分析，从而对所述方法的恰当性提出了怀疑。因此，本专利技术提出了另一种可以有效用于生物样品的方法，其结合了对生物样品的组分进行分离的毛细管电泳和对可能存在于待分析生物样品中的Mc蛋白质进行分型的免疫扣除。本专利技术的方法的一个优势在于，当Mc蛋白质存在于生物样品中并经毛细管电泳分离时，所述方法允许对应于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对生物样品进行毛细管电泳分析的方法，包括采用带有超额负电荷的修饰抗体，以使当生物样品中蛋白在电泳过程中被分离时，所述修饰抗体迁移至位于生物样品中蛋白的迁移区域之外的区域，所述抗体具有针对预定靶蛋白的抗原特异性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：弗雷德里克罗贝尔，雷吉斯安德烈，
申请(专利权)人：莎碧亚公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]