同时检测传染性微生物的抗原及抗体的方法技术

本发明专利技术涉及一种体外检测方法，其通过同时检测微生物（如丙型肝炎病毒）的抗原和针对这同一种抗原的抗体，体外检测生物样品中该微生物的感染，还涉及实施该方法的试剂和试剂盒。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及传染性微生物特别是病毒微生物感染的体外检测，具体而言，涉及丙型肝炎病毒(HCV)感染的体外检测。更准确地说，本专利技术也涉及一种方法，用于同时检测传染性微生物特别是病毒微生物的抗原和针对该传染性微生物的抗体，还涉及实施该方法的试剂和试剂盒。更具体而言，涉及一种同时检测HCV抗原和抗HCV抗体的方法，以及实施该方法的试剂和试剂盒。丙型肝炎病毒感染是一种肝炎形式，最初被称为非甲非乙肝炎，是一个早就认识到的健康问题，特别是在输血方面。1989年5月31日公开的专利申请EP 318 216描述了引起人类丙型肝炎的病毒(被称为HCV)的cDNA片段的克隆。也描述了编码该病毒的非结构蛋白(NS1-NS5)的5个基因的序列(约占HCV总基因组的78％)，C100-3抗原(其含有NS3-NS4区的363个氨基酸，与超氧化物歧化酶融合)，以及利用C100-3抗原检测抗HCV抗体的方法。这种检测抗HCV抗体的“第一代”方法能够确定HCV是非甲非乙肝炎(现在世界上称为丙型肝炎)的一个主要原因。然而，该方法不能检测70-80％以上的该病毒感染的血清。这种灵敏度的不足使之不能进行感染的早期检测。Okamoto等人(1990a)和1990年9月19日公开的专利申请EP 388 232描述了HCV病毒基因组的5’端序列，即编码导致丙型肝炎的病毒的结构蛋白(衣壳、基质、包膜)的基因序列。Okamoto等人(1990b)发表了HCV衣壳的氨基酸39-74序列作为靶标通过ELISA检测抗HCV抗体的用途。Hosein等人(1991)的文章描述了一种检测抗HCV抗体的免疫测定法，它以使用结构(衣壳在AA 1-120区中)和非结构(NS3-NS4在AA1200-1800区中)合成肽抗原为基础。已经证明了合成肽在抗HCV抗体检测中的优点，以及结构与非结构抗原组合的优点这种组合可提高灵敏度，因此可以及早检测。此处所述的测定法能够早4-10周检测抗体。该文也显示，不存在主要的优势免疫表位，例如，已知AIDS病毒同样如此。Nasoff等人(1991)指出，衣壳的大多数优势免疫反应性表位位于N端区(AA 1-40)，针对这些表位的抗体在感染后很快产生。检测抗HCV抗体的“第二代”测定法(即以同时使用非结构和结构捕获抗原为基础的测定法)比第一代测定法有显著进步。然而，它们仍然缺乏灵敏性具体的，它们最多检测95-98％的采自HCV感染患者的血清。因此，这种检测还不能足够早期地检测，仍然会使感染的捐献血液在输血中不被注意地通过。实际上，为了降低输血后的危险，必须在感染之后在出现抗体之前尽可能早地检测病毒本身的存在。感染与血清转变(即抗体出现)之间的阶段被称为“血清学窗口期”。有多个研究团队(Garson等人(1990)；Shieh等人(1991))提出，为了解决上述灵敏度和早期检测问题，可通过PCR(聚合酶链反应)检测病毒RNA。该方法实际上可以极其灵敏地早期检测HCV感染，也就是说，只在接触病毒几天后，即循环抗病毒抗体增多之前4-8周即可检测。目前，这是检测生物液体中的病毒的参考方法。然而，用于HCV的PCR方法也遇到许多困难。首先，它包括进行RNA提取、纯化，然后将RNA逆转录为cDNA的前期步骤，病毒材料的一部分在这些前期步骤中丢失。其次，它需要特殊、昂贵的扩增设备。另外，它也不能同时处理大量样品，并且常常产生污染。目的在于早期检测HCV感染的另外一种方法旨在检测循环病毒抗原(衣壳)。这种抗原也在血清抗HCV抗体出现前几周出现。Takahashi等人(1992)描述了一种ELISA技术，它利用一对抗体检测衣壳抗原。然而，这种抗原的检测难以建立，这主要是因为血液中可检测的抗原滴度低，以及可以获得的免疫试剂的质量问题。Hajime Tokita等人(2000)描述了一种使用一对单克隆抗体(5F11和5E3)的夹心型免疫测定法，在市场上被称为“Immucheck F HCV Ag CoreKokusai”，它可获得极其灵敏的检测。该文章的作者强调，衣壳蛋白中的Thr49Pro突变可降低测定的灵敏度。Peterson等人(2000)也在研究早期检测衣壳抗原，他们建立了一种ELISA技术，该技术不需要预处理样品即可利用抗衣壳单克隆抗体检测HCV的衣壳抗原。该文章通过比较三种独立的测定法(PCR检测HCV RNA，ELISA检测抗HCV抗体和衣壳抗原)表明，能够有效地检测在感染早期血清阴性阶段(即检测到RNA约1天后)采集的血袋中的循环HCV衣壳抗原。丙型肝炎病毒感染的早期检测，以及在感染持续期间检测血清转变后抗体反应的可能性，仍然是当前的一个目标，特别是对于输血而言。根据建立简单、灵敏、特异、可重复、经济、易于进行并且能够自动化——旨在进行大量筛选——的方法的观点，最希望首先在血清学窗口期检测HCV抗原，然后在血清转变后追踪患者的血清学进化，联合抗HCV抗体的检测和HCV抗原的检测。然而，这就提出了一个重要问题，即对于HCV抗原的测定，血清中存在的抗HCV抗体与标记的抗HCV抗体之间的干扰问题。因此，为了检测一种指定抗体，向固相上引入一种靶抗原，而这种靶抗原与标记抗体或用于同时夹心法检测抗原的抗体可识别的抗原可能具有相同的表位，这将不可恢复地使标记的一种或多种抗体与固相结合，因此使测定产生假阳性反应。对于在同一固相上同时检测抗HCV衣壳抗体和HCV衣壳抗原的系统，尤其如此。因此，为了检测抗HCV衣壳抗体，衣壳抗原在固相上沉积，其中这种衣壳抗原与标记的抗HCV衣壳抗体或用于检测衣壳抗原的抗体可识别的抗原具有相同的表位，这将使标记的一种或多种抗体与固相结合，使测定产生假阳性反应。为了避免这种干扰的危险，Chiron公司进行了检测患者的衣壳抗原以及只检测抗NS3/NS4抗体的测定。为此，Chiron首先使用与固相附着的NS3/4a抗原来捕获待测样品中的抗HCV抗体，然后使用同样为附着的单克隆抗HCV衣壳抗体(c11-3和c11-7)。在过氧化物酶标记的单克隆抗体存在下，利用与SOD(超氧化物歧化酶)融合的抗原检测捕获的抗体，而捕获的抗原利用同样以过氧化物酶标记的另外一种单克隆抗体检测(第七届国际输血学会欧洲会议(VII European Congress of theInternational Society of Blood Transfusion)巴黎，2001年7月15-18日)。针对干扰问题，专利申请EP 1 020 727(Advanced Life ScienceInstitute)提供了一种同时测定HCV衣壳抗原和抗HCV衣壳抗体的方法(一种“combo”型测定法)，其中该抗原被针对衣壳表位的抗体捕获并标记，其中这些衣壳表位与同时用来捕获并显示或检测抗衣壳抗体的衣壳表位不同。它给出了一个代表性实施例，其中在通过夹心法检测抗原、同时通过间接法检测抗体的测定中，为了检测抗原，使用针对HCV衣壳的氨基酸(AA)100-氨基酸130序列的表位的第一抗体(捕获抗体)，和针对序列AA40-50的表位的第二抗体(检测抗体)，为了检测抗体，使用的捕获抗原自身含有序列AA1-42和AA66-80。然而，该方法不是没有缺点，特别是它需要使用针本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外检测生物样品中微生物感染的方法，包括同时检测生物样品中存在的该微生物的至少一种抗原和针对该微生物的一种抗体，该方法包括：ａ）使生物样品接触针对该微生物的捕获抗体，和来源于该微生物的捕获抗原；ｂ）在允许形成抗原－抗体复 合物的条件下温育该混合物；ｃ）显示形成的抗原－抗体复合物，任选地使用一种标记的检测抗体，和／或任选地一种标记的检测抗原，该检测抗体能够结合已经被捕获的该微生物的抗原，该检测抗原能够结合于已经被捕获的针对该微生物的抗体；其中该 微生物的捕获抗原和／或标记的检测抗原包含该微生物的抗原性片段，其中至少一个表位已经被破坏；该捕获和／或检测抗体可识别已经被捕获的抗原的该完整表位。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：F里厄尼耶，M费萨盖，S昂利奥，N朗贝尔，
申请(专利权)人：比奥拉德巴斯德公司，
类型：发明
国别省市：FR[]