白斑症病毒现场检测试纸及其制备、使用方法技术

本发明专利技术是白斑症病毒现场检测试纸，包括：不干胶载体板；保藏号为：ＣＣＴＣＣ－Ｃ２００４２１杂交瘤细胞所分泌的抗白斑症病毒的、胶体金标记的金标单抗Ｅ；保藏号为：ＣＣＴＣＣ－Ｃ２００４２３杂交瘤细胞所分泌的抗白斑症病毒的单抗Ｆ和羊抗小鼠ＩｇＧ。在该载体板的两端部，设有加样端吸水层和手持端吸水层；在该载体板中部段设有硝酸纤维膜的检测层，在该检测层与加样端吸水层交界处，设有载有金标单抗Ｅ的玻璃纤维层块，该层块一端部分设置在加样端吸水层之下，其另一端部分设置在该检测层之上；在与该层块延续的检测层上设有检测线和质控线，该检测线和质控线处分别包被有单抗Ｆ和羊抗小鼠ＩｇＧ。该试纸制备方法简单、稳定性、重复性好，具有简便、快速、现场、准确、灵敏的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及养殖病害病原检测技术的改进，具体讲是一种白斑症病毒(white spot syndromevirus，WSSV)现场检测试纸及其制备、使用方法，其属于免疫学和病毒学交叉

技术介绍
白斑症病毒病是对虾养殖中危害严重的疾病之一，导致很高的对虾死亡率，给对虾养殖业造成了巨大的损失。鉴于白斑症尚无有效的治疗方法，快速准确的病毒分离检测技术已成为各国学者研究的焦点之一。目前，白斑症病毒病的诊断主要是依靠实验室内对白斑症病毒检测来确诊，现实验室检测方法有PCR法；DNA探针原位杂交法；透射电镜观察法；光镜下HE染色观察法，酶联免疫吸附检测法以及斑点免疫印迹检测法等。这些方法，操作程式较为复杂，需要一定的实验室仪器设备，且耗时较长，整个过程需要几个乃至十几个小时，达不到快速、现场检测的目的。PCR法灵敏度高，可用于无症状病虾的检测，但其高灵敏度易导致假阳性结果；酶联免疫吸附检测法及斑点免疫印迹检测法，是目前常用的检测方法，但被检组织的内源酶可以对其检测结果产生干扰，导致假阳性的出现。因此一种适用于水产养殖病害病原的快速、准确、简便、现场、无假阳性的检测方法的研制势在必行，以期达到早发现、早预防的目的。
技术实现思路
本专利技术的是针对白斑症病毒病严重危害对虾养殖业的现状，迫切需要一种简便、快速、现场、准确的检测方法和低等水生生物生理特点而设计专利技术的，以达到快速、简便、现场、准确的检测目的。本专利技术的目的是由以下技术方案实现的，研制了一种白斑症病毒现场检测试纸，具包括适当尺寸的不干胶载体板；保减号为CCTCC-C200421杂交瘤细胞所分泌的抗白斑症病毒的、胶体金标记的单克隆抗体E(简称金标单抗E)；保藏号为CCTCC-C200423杂交瘤细胞所分泌的抗白斑症病毒的单克隆抗体F(简称单抗F)和羊抗小鼠1gG(简称羊抗鼠IgG)。在该载体板的两端部，分别设有加样端吸水层和手持端吸水层；在该载体板中部段设有硝酸纤维膜的检测层，在该检测层与加样端吸水层交界处，设有载有金标单抗E的玻璃纤维层块，该层块一端部分设置在加样端吸水层之下，其另一端部分设置在该检测层之上；在与该层块延续的检测层上设有检测线和质控线，该检测线和质控线处分别包被有单抗F和羊抗鼠IgG。所述的金标单抗E，其制备方法如下(1)胶体金的制备以公知的胶体金的制备工艺将氯金酸溶液与柠檬酸钠混合，加热制成胶体金溶液；(2)金标单抗E的制备将单克隆抗体E加入到上述(1)步的胶体金溶液中，慢搅混匀，加入牛血清白蛋白，离心后的沉淀用含有牛血清白蛋白、叠氮钠的磷酸盐缓冲液悬起，制成金标单抗E液体；(3)载有金标单抗E的玻璃纤维层块的制备将上述(2)步制成的金标单抗E液体，喷在玻璃纤维膜上至液体开始渗出为止，冷冻干燥，4℃保存备用。一种白斑症病毒现场检测试纸的使用方法首先，使用病毒提取装置，快速地从被检测的虾鳃中提取白斑症病毒，制备检测样品；然后，手持该试纸的手持端，将该试纸的加样端吸水层插入或在其上滴加该检测样品，5分钟内在位于检测层下端的检测线和在位于检测层上端的质控线处显示红色，即双红线，表示白斑症病毒阳性和检测试纸有效。所述的制备检测样品的过程是使用由试管和捣碎棒组成的病毒提取装置，先将试管中加入液体，然后，取被检虾腮加入至试管中，用捣碎棒将其充分捣碎，使病毒释放于该试管液体中，即制成检测样品。所述的加入试管中的液体，其是池塘水，蒸馏水，自来水，pH6.0-8.0的磷酸盐缓冲液，pH6.0-8.0的Tris-氯化钠缓冲液中的任意一种。本专利技术的优点在于本专利技术以现有技术的实际特点，研制了一种白斑症病毒快速现场检测试纸及其制备、使用方法，采用从靶器官中简单的提取病毒，直接对含病毒的检测样品液进行检测，其原理是白斑症病毒现场检测试纸采用夹心免疫层析原理，即由金标单抗E同检测样品液中的抗原反应，形成由金标单抗E-白斑症病毒复合物，当该复合物层析至硝酸纤维素膜上预先包被在检测线上的单抗F处时，此处的抗体会识别该复合物中抗原，反应的结果便形成了金标单抗E+白斑症病毒抗原+单抗F的夹心结构，最终是单抗E上标记的胶体金颗粒在此固定并累积出现肉眼可见的红色线，未反应的金标单抗E则仍继续层析前行，当到达点预先包被在质控线羊抗鼠IgG处时，抗体类型为IgG的金标单抗E被其结合住，从而在此处也出现由胶体金颗粒固定并累积而显现出肉眼可见的红色线，结果是检测线显示红色表示白斑症病毒阳性；检测线不显示红色，表示白斑症病毒阴性，即检测样品中不含白斑症病毒或是白斑症病毒含量极低。质控线显示红色，表示试纸有效；质控线处不显示红色，说明试纸失效，即或是金标抗体E、或是羊抗鼠IgG失活，检测结果无效。本专利技术的特点是(1)本专利技术的白斑症病毒现场检测试纸，具有简便、快速、现场、准确、灵敏等特点，无需专门设施和操作技术，适于普通养殖户池边检测。(2)本专利技术的白斑症病毒现场检测试纸使用方法中，由小管与捣碎棒组成的快速病毒提取装置，可直接取池塘水或自来水等用于提取病毒的媒介液，无需加入特殊的裂解液；只需将虾鳃捣碎即可，与传统病毒提取研磨、离心等方法相比，此法方法方便、简单、快速，达到现场提取病毒检测的目的。(3)本专利技术的白斑症病毒现场检测试纸，制备方法简单、稳定性、重复性好。经实际应用证明本专利技术的白斑症病毒现场检测试纸具有简便、快速、现场、准确、灵敏的特点。附图及其具体实施方式本专利技术的实施例结合附图进一步描述如下附图说明图1白斑症病毒现场检测试纸示意图；图2白斑症病毒现场检测试纸的检测结果示意图。参见图1，2本专利技术白斑症病毒现场检测试纸，其包括适当尺寸的不干胶载体板7；保藏号为CCTCC-C200421杂交瘤细胞所分泌的抗白斑症病毒的、胶体金标记的单克隆抗体E(简称金标单抗E)；保藏号为CCTCC-C200423杂交瘤细胞所分泌的抗白斑症病毒的单克隆抗体F(简称单抗F)和羊抗小鼠IgG(简称羊抗鼠IgG)。在该载体板7的两端部，分别设有加样端4吸水层和手持端1吸水层；在该载体板7中部段设有硝酸纤维膜的检测层2，在该检测层2与加样端4吸水层交界处，设有载有金标单抗E的玻璃纤维层块3，该层块3一端部分设置在加样端4吸水层之下，其另一端部分设置在该检测层2之上；在与该层块3延续的检测层2上设有检测线6和质控线5，该检测线6和质控线5处分别包被有单抗F和羊抗鼠IgG。实施例1. 所述的单抗E胶体金标记方法为(1)胶体金的制备18-20nm胶体金颗粒制备，将0.01％氯金酸溶液100ml与0.1％柠檬酸钠2.5ml混合，加热致100℃制成胶体金溶液，该溶液的pH值用0.2％碳酸钾调至8.0-8.4，备用；(2)金标单抗E的制备将1μl抗体加入1ml胶体金中，混均，加入10％氯化钠100μl，观察颜色变化，如果变蓝，则说明抗体不足，再不断的增加抗体量，直至胶体金颜色不变为准，在此基础上，将此抗体量增加50-100％，此时为1ml胶体金标记的最适单抗量。用此适宜单抗量进行胶体金标记，标记后的胶体金无沉淀、无非特异性吸附，达到实验标准。按此最适单抗量，即单抗E浓度为0.5-2g/L时，1ml胶体金标记的最适单抗量为15-20μl。将单抗E加入到胶体金溶液中，慢搅10min，加入1％牛血清白蛋白，4℃过夜；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种白斑症病毒现场检测试纸，其包括：适当尺寸的不干胶载体板；保藏号为：ＣＣＴＣＣ－Ｃ２００４２１杂交瘤细胞所分泌的抗白斑症病毒的、胶体金标记的单克隆抗体Ｅ（简称：金标单抗Ｅ）；保藏号为：ＣＣＴＣＣ－Ｃ２００４２３杂交瘤细胞所分泌的抗白斑症病毒的单克隆抗体Ｆ（简称：单抗Ｆ）和羊抗小鼠ＩｇＧ（简称：羊抗鼠ＩｇＧ），其特征在于：在该载体板的两端部，分别设有加样端吸水层和手持端吸水层；在该载体板中部段设有硝酸纤维膜的检测层，在该检测层与加样端吸水层交界处，设有载有金标单抗Ｅ的玻璃纤维层块，该层块一端部分设置在加样端吸水层之下，其另一端部分设置在该检测层之上；在与该层块延续的检测层上设有检测线和质控线，该检测线和质控线处分别包被有单抗Ｆ和羊抗鼠ＩｇＧ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：战文斌，王晓洁，林颖博，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]