在蛋白质如病原性/传染性蛋白质中诱导构象转变的方法技术

本发明专利技术涉及一种在蛋白质中诱导构象转变的体外方法，而所述构象转变导致β折叠二级结构的含量升高，该方法包括步骤：ａ）提供一种转变缓冲液；ｂ）向转变缓冲液中加入含有带负电荷脂质的层状脂质结构的溶液；ｃ）向转变缓冲液中加入蛋白质分子；ｄ）由转变缓冲液、添加的脂质和蛋白质分子形成一种样品混合物；ｅ）在样品混合物中确定转变温度；和ｆ）将步骤ｄ）的样品混合物置于根据步骤ｅ）的转变温度下足够的时间以形成构象转变的蛋白质。通过这一方法，形成了层状脂质结构和构象转变蛋白质的水溶性复合物，所述构象转变的蛋白质为寡聚的β折叠中间型结构。可以通过有效地破坏层状脂质结构由层状脂质结构和寡聚的β折叠中间型结构的水溶性复合物产生淀粉样聚集物。这类蛋白质可能涉及神经变性疾病像传播性海绵状脑病（ＴＳＥ）、阿尔茨海默症、多发性硬化症和帕金森病。说明书包括通过该方法生产的蛋白质的应用，例如，开发ＰｒＰＣ向ＰｒＰ↑［Ｓｃ］转变的不同相；开发新的用于诊断的ＴＳＥ检测方法以及抗ＴＳＥ如人克－雅氏病的潜在的治疗方法和预防方法。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
相关申请资料本专利申请要求于2002年7月11日递交的美国临时申请号60/395,203的优先权，这里并入其全部公开内容作为参考。
技术介绍
虽然蛋白质折叠的中心范例(Anfinsen，C.B.(1973)蛋白链折叠的指导原则Principles That Govern Folding of Protein Chains.Science，181，223-230)，蛋白质的氨基酸序列编码其独特的三维结构得到了充分证实，但由于最近发展的“朊病毒”的概念使其共性受到了质疑。如首先由Griffith(Griffith，J.S.(1967)自复制和羊瘙痒病Self-replication andscrapie.Nature，215，1043-1044)以通用术语所提出的，引发中枢神经系统退化的传染性羊瘙痒病物质的生化特性显示了疾病传播所必需的成分是蛋白质(Prusiner，S.B.(1982)导致羊瘙痒病的新的蛋白质传染性颗粒Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.Science，216，136-144)。朊病毒增殖进一步包括由称为PrPC的细胞型朊病毒蛋白向有毒性的羊瘙痒病形式PrPSc的转变，通过PrPSc作为模板用于PrPC形成新的PrPSc分子推动了这一转变(Prusiner，S.B.(1987)朊病毒和神经变性疾病Prions and neurodegenerative diseases.N Engl J Med，317，1571-1581)。这种“唯蛋白质”假说暗示同样的多肽序列，在不存在任何翻译后修饰的情况下，能够采用两种明显不同的稳定的蛋白质构象。因而，对于朊病毒来说有可能，尽管没有证实，它们违背了蛋白折叠的中心范例。有一些间接的证据即其它因子可能涉及构象转变过程(Prusiner，S.B.(1998)朊病毒Prions.Proc Natl Acad Sci USA，95，13363-13383)，该过程包括一种由α螺旋变为β折叠二级结构的显著改变。尽管有人提出一种假定的“因子X”可能作为一种分子伴侣而起作用，但其化学特性却一直未得到鉴定(Zahn，R.(1999)朊病毒传播和分子伴侣Prion propagationand molecular chaperones.Q Rev Biophys，32，309-370)。因而“因子X”可能是一种蛋白质、一种脂质、另一种生物大分子或其组合。对于PrPSc促进细胞同工型的转变的分子机制已提出两种通用的模型(见附图说明图1)。关于PrPSc形成的“晶核形成”或“结籽”模型(Jarrett，J.T.和Lans-bury，P.T.，Jr.(1993)淀粉体的“一维结晶”为引入种晶一种在阿尔茨海默症和羊瘙痒病中的致病机制？Seeding″one-dimensionalcrystallization″of amyloida pathogenic mechanism in Alzheimer′sdisease and scrapie？Cell，73，1055-1058)提出PrPC和PrPSc处于快速建立的平衡态中，并且PrPSc的构象只有在陷入于晶体样的晶种内时才是热动力学稳定的(见图1A)。该建议的过程类似于充分描述了特性的成核依赖的蛋白质聚合作用的其它过程，包括微管装配、鞭毛装配以及镰状红细胞血红蛋白原纤维的形成，其中动力学势垒是由单分子周围成核所致。为阐明指数式转变速率，必须假定聚集物不断地分裂以产生增加的堆积表面，尽管分裂的机制还有待于解释。PrPSc形成的“模板辅助”或“异二聚体”的模型(Prusiner，S.B.，Scott，M.，Foster，D.，Pan，K.M.，Groth，D.，Mirenda，C.，Torchia，M.，Yang，S.L.，Serban，D.，Carlson，G.A.等(1990)转基因研究暗示了羊瘙痒病朊病毒复制中同源PrP同工型之间存在相互作用Transgenetic studies implicate inter-actions betweenhomologous PrP isoforms in scrapie prion replication.Cell，63，673-686)提出PrPC在一定程度上是未折叠的并在作为模板起作用的PrPSc分子的作用下重折叠(见图1B)。在没有通过预先存在的PrPSc催化的情况下，高的能量势垒被假定使得这种转变不可能发生。构象变化被认为是通过PrPC-PrPSc异二聚体分解为两个PrPSc分子进行动力学控制的，且能被视为是一种继Michaelis-Menten动力学自动催化之后的一种诱导装配的酶反应。一旦转变开始启动其就引起一种指数式的转变级联，与此同时PrPSc二聚体快速地解聚为单体。模板辅助模型的一个缺点是它没有解释为什么在增殖后PrPSc会聚集为蛋白质原纤维。Manfred Eigen曾进行过朊病毒的两种建议的疾病机制的比较动力学分析(Eigen，M.(1996)Prionics或朊病毒疾病的动力学基础Prionics or the kinetic basis of prion diseases.Biophysical Chemistry，63，A1-A18)。他发现大体而言两种模型在逻辑上都是可行的，但是它们作用过程中的条件似乎是过于狭窄且不切实际。自动催化的模板辅助模型需要协同效应以启动，但接着其在现象上变得与成核模型无法区分，该成核模型也是一种(被动的)自动催化的形式。尽管这两种机制依然可能在两种单体蛋白质构象的哪一种是有利的平衡态的问题上产生不一致，但它们二者都需要一种聚集态作为最终在平衡上有利的形式以及假定类似朊病毒蛋白质的病理形式。Eigen推断需要更多的实验证据来判断两种模型的哪一种是正确的。原则上，对于朊病毒增殖的两种模型都没有排除可能的通过“因子X”的协同作用。对一种朊病毒疾病的机理的理解需要细胞型和病理型朊病毒蛋白的三维结构的详细知识。只有两种蛋白的结构都得到了解释，那么才能够理解转变是如何发生的。在体内，“健康的”朊病毒蛋白通过一种糖基化肌醇磷酯锚和称为脂质筏的膜结构域部分而附于细胞表面(Vey，M.，Pilkuhn，S.，Wille，H.，Nixon，R.，DeArmond，S.J.，Smart，E.J.，Anderson，R.G.，Taraboulos，A.和Prusiner，S.B.(1996)细胞的亚细胞共区域化和在细胞膜穴样内陷类似膜结构域中的羊瘙痒病朊病毒蛋白Subcellularcolocalization of the cellular and scrapie prion proteins incaveolae-like membranous domains.Proc Natl Acad Sci U S A，93，14945-14949)。近来的结构研究集中在使用核磁共振(NMR)波谱法研究来自不同物种的可溶性重组朊病毒蛋白。这些研究显示了哺乳动物PrPC由两个不同的结构域组成一个柔性无序的N端尾部，它包含残基23-120，以及残基121-230的一个井状结构本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在重组蛋白质和／或其变体中诱导构象转变的体外方法，其中所述的构象转变导致β折叠二级结构含量的增加，该方法包括步骤：ａ）提供一种转变缓冲液；ｂ）向转变缓冲液中加入含有带负电荷脂质的层状脂质结构的溶液；ｃ）向转变缓冲 液中加入重组的蛋白质分子和／或其变体；ｄ）由转变缓冲液、添加的脂质和蛋白质分子形成一种样品混合物；ｅ）在样品混合物中确定转变温度；和将步骤ｄ）的样品混合物置于根据步骤ｅ）的转变温度下足够的时间以形成构象转变的蛋白质； 其中形成层状脂质结构和构象转变的蛋白质的水溶性复合物，构象转变的蛋白质为寡聚的β折叠中间态结构。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：R扎恩，T吕尔斯，
申请(专利权)人：瑞士联邦苏黎世技术大学，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]