重组Bet-V-1过敏原突变体及其方法和制备技术

本发明专利技术公开了带有多个突变且ＩｇＥ结合亲合力被降低了的新型重组过敏原。该过敏原是来自天然过敏原的突变体。其基本上保留了总体α－碳骨架的三级结构。还公开了制备该重组过敏原的方法及其用途。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及过敏反应的诊断和治疗。更具体而言，本专利技术提供了获得突变过敏原分子的方法，所述分子可用于过敏反应的诊断和治疗。本专利技术还涉及新型重组过敏原及其应用，所述过敏原是天然存在的过敏原的突变体。另外，本专利技术还涉及含有重组过敏原混合物的药用组合物。本专利技术还涉及这种重组突变过敏原的制备方法以及含有该重组突变过敏原的药物组合物和疫苗。在一些实施方案中，本专利技术涉及在受试者中产生免疫应答，接种或治疗受试者的方法以及制备本专利技术组合物的方法。
技术介绍
遗传上易感的个体可被个体所接触的各种环境来源产生的抗原或过敏原致敏(过敏)。当以前致敏的个体再接触相同或同源的过敏原时会发生过敏反应。过敏反应的范围包括枯草热、鼻传导疾病(rhinoconductivitis)、鼻炎、哮喘和全身性过敏病以及例如由于蜜蜂或大黄蜂螫伤或昆虫咬伤所引起的死亡。该反应是即时的且可由各种特异反应性过敏原引起，例如，来自草类，树木，杂草，昆虫，食物，药品，化学物质和香料等的化合物。然而，当个体首次接触过敏原时不出现这类反应。开始的适应性应答需要时间且通常不引起任何症状。但当已产生能与过敏原反应的抗体和T细胞时，任何随后的接触都可能激发症状。因此，过敏反应表明免疫应答本身可引起威胁生命的重大病理状态。特异反应性过敏反应涉及的抗体主要属于IgE型免疫球蛋白。IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面上的特异性受体结合。特定的过敏原与结合于肥大细胞上的IgE形成复合物后，受体在细胞表面交联，导致通过该受体产生信号传导和形成靶细胞的生理反应。肥大细胞的脱粒导致释放组胺，肝素，嗜酸性白细胞趋化因子，白三烯C4、D4和E4，它们会引起支气管平滑肌细胞持续收缩。在自然情况下产生的效应可以是全身性的或是局部的。抗体介导的过敏性反应可分成4类，即I型，II型，III型和IV型。I型过敏反应是典型的即时过敏反应，在接触抗原后几秒或几分钟内发生。其症状由过敏原特异性IgE介导。通常，观察到的过敏反应是对存在于诸如花粉，室内粉尘螨，动物毛发和头皮屑，毒液和食品中的蛋白质过敏原发生的反应。为了减小或消除过敏反应，通常使用仔细控制和重复地施用过敏反应疫苗。传统上经过肠胃外、鼻内或舌下用药进行过敏反应疫苗接种，在相当长的时间期间内不断增加剂量，导致病人脱敏。尚未知道精确的免疫学机制，但有人认为在过敏原特异性T细胞表型方面诱导的差异特别重要。过敏反应的疫苗接种疫苗接种的概念以免疫系统的两个基础特征，即特异性和记忆性为基础。疫苗接种会引发受体的免疫系统，当重复接触相似蛋白时，免疫系统会对诸如微生物感染之类的攻击发生更强烈的应答。疫苗是用于接种以在受体中产生这种保护性免疫反应的蛋白混合物。保护仅包括存在于疫苗中的成份和同源抗原。与其它类型的疫苗接种相比，过敏反应接种由于在过敏反应病人中存在正进行的免疫反应从而更加复杂化。这种免疫反应的特征在于存在过敏原特异性IgE，当接触过敏原时介导过敏反应症状出现。因此，使用来自天然来源的过敏原进行过敏反应接种具有固有的危险，其副作用的最坏后果可能会威胁患者的生命。围绕该问题的研究方法可分成3类。在实际中常结合使用多类方法。第一类方法包括在较长的时间内施用一些小剂量以达到较大的累积剂量。第二类方法包括将过敏原掺入诸如氢氧化铝的凝胶物质中对过敏原进行物理修饰。氢氧化铝制剂具有佐剂效应和延缓过敏原释放以降低活性过敏原成份组织浓度的贮藏效应。第三类方法包括化学修饰过敏原以降低过敏原性，即IgE的结合性。成功的过敏反应接种的详细机制还存在争议。然而，已认可T细胞在免疫反应的总体调节中起关键作用。根据目前的共识，T细胞的两种极端表型，Th1和Th2之间的关系决定了个体的过敏反应状态。当用过敏原刺激时，Th1细胞分泌白细胞介素，主要是干扰素-γ，导致保护性免疫，而该个体是健康的。另一方面，Th2细胞主要分泌白细胞介素4和5，导致IgE合成和嗜曙红细胞增多，而该个体是过敏性的。体外研究表明，用含相关T细胞表位的肽衍生的过敏原攻击则有可能改变过敏原特异性T细胞的反应。因此目前对新的过敏反应疫苗的研究主要以针对T细胞为基础，目的在于使T细胞(过敏反应诱导)沉默或使反应从Th2表型转换为Th1表型。结合抗体的表位(B-细胞表位)Fab抗原复合物的X-射线晶体学分析增进了对结合抗体的表位的了解。根据这类分析，结合抗体的表位可定义为含有15-25个氨基酸残基的原子的抗原表面部分，它们与能直接相互作用的抗体原子保持在一定的距离内。抗原-抗体相互作用的亲和性不能单独从范德华相互作用、氢键或离子键所产生的焓来推测。其能量贡献的大小相似于水分子从界面几乎完全脱离所需的焓。这意味着相互作用的分子外形之间的高度匹配是进行抗原-抗体高亲和性相互作用的主要因素。在WO 97/30150(参考文献1)中要求保护一组蛋白质分子，该蛋白质分子与亲本蛋白质相比在氨基酸序列中分布着特定的突变。根据其说明书，似乎该专利技术涉及产生与亲本蛋白质相比修饰过的类似物，但它们与亲本蛋白质(天然存在的过敏原)以相同的方式被吸收、消化并呈递给T细胞。因此，获得有所改变的T细胞反应。修饰蛋白质的文库使用称为PM(简约原则的诱变)的技术制备。在WO 92/02621(参考文献2)中描述了重组的DNA分子，该分子包含编码具有山毛榉目中树的过敏原至少一个表位的多肽的DNA，该过敏原选自Alng1，Cora1和Betv1。文中描述的重组分子确实都具有相应于天然存在的过敏原序列的氨基酸序列或部分氨基酸序列。WO 90/11293(参考文献3)涉及分离的豚草花粉过敏原多肽和修饰的豚草花粉肽。其中公开的多肽具有相应于天然存在的过敏原或其天然存在的同种型序列的氨基酸序列。过敏原的化学修饰对过敏原的化学修饰已进行了一些研究。七十年代早期的科学研究包括将过敏原化学偶联到多聚体上和使用甲醛等化学交联过敏原产生所谓的“过敏原类似物(allergoids)”。这些研究的基本原理是经过附着化学配体随机破坏IgE结合表位从而降低IgE结合，同时因增加复合物的分子量而保持其免疫原性。与“过敏原类似物”生产的内在缺陷相关联的是难以控制化学交联过程和难以分析及标准化所得的高分子量复合物。“过敏原类似物”目前用于临床，且由于随机破坏了IgE结合表位，故与常规疫苗相比可施用更高的剂量，但相对于常规疫苗的使用并没有提高安全性和效力参数。化学修饰过敏原的更近期的研究集中于总体破坏过敏原的三级结构，从而消除IgE结合，其中假定基本治疗靶是过敏原特异性T细胞。该疫苗含有来自过敏原序列的代表最小T细胞表位的合成肽，代表相连T细胞表位的较长肽，来自较长过敏原序列、代表免疫显性T细胞表位区域的合成肽，或以重组技术切成两半的过敏原分子。根据这一基本原理的另一方案是建议使用“低IgE结合”的重组同种型。在最近几年中，已清楚天然的过敏原是异源性的，其中含有同种过敏原(isoallergen)和具有多达大约25％氨基酸被取代的变体。已发现一些重组的同种过敏原在IgE结合中效率较低，这很可能是由于不可逆的变性且因此总体上破坏了三级结构。体外诱变和过敏反应接种使用一些过敏原经过体外定点诱变进行了降低过敏反应性的尝试。这些过敏原包括Derf2(Takai等，文献4)，D本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组Ｂｅｔｖ１过敏原，其特征在于它是天然Ｂｅｔｖ１过敏原的突变体，其中：ａ．该突变体保持与所述天然过敏原基本相同的α－碳骨架结构，ｂ．该突变含有至少４个一级突变，与天然Ｂｅｔｖ１过敏原的ＩｇＥ结合能力相比，每种突变都能够将突变过敏原的ＩｇＥ特异性结合能力降低，ｃ．每种一级突变都是一种表面暴露的氨基酸残基被另一种所取代，ｄ．所述突变位点的放置方式使得：在至少一个４００－８００＊↑［２］的面积内不含有突变或仅含有一个或多个温和突变，ｅ．所述一级突变选自下述１０组中的至少４组，每组均含有适于氨基酸取代的表面暴露的氨基酸位点：组１：Ａ１３０，Ｅ１３１，Ｋ１３４，Ａ１３５，Ｋ１３７，Ｅ１３８，Ｅ１４１，Ｔ１４２，Ｒ１４５；组２：Ｖ２，Ｆ３，Ｎ４，Ｙ５，Ｅ６，Ｔ７，Ｋ１１９；组３：Ｄ２７，Ｓ３９，Ｓ４０，Ｙ４１，Ｅ４２，Ｎ４３，Ｉ４４，Ｅ４５，Ｇ４６，Ｎ４７，Ｐ５０，Ｇ５１，Ｋ５５，Ｄ７２，Ｅ７３；组４：Ｅ８，Ｔ１０，Ｖ１２，Ｐ１４，Ｖ１０５，Ａ１０６，Ｔ１０７，Ｐ１０８，Ｄ１０９，Ｇ１１０，Ｉ１１３，Ｋ１１５；组５：Ａ１６，Ｋ２０，Ｓ１４９，Ｙ１５０，Ｌ１５２，Ａ１５３，Ｈ１５４，Ｓ１５５，Ｄ１５６，Ｙ１５８，Ｎ１５９，＋１６０，其中＋１６０代表Ｎ－末端氨基酸的增加；组６：Ｌ２４，Ｄ２５，Ｎ２８，Ｋ３２；组７：Ｈ７６，Ｔ７７，Ｎ７８，Ｆ７９，Ｋ８０，Ｅ１０１，Ｋ１０３；组８：Ｋ６８，Ｒ７０，Ｉ８６，Ｅ８７，Ｅ９６，Ｋ９７；组９：Ｇ１，Ｇ９２，Ｄ９３，Ｔ９４，Ｋ１２３，Ｇ１２４，Ｄ１２５，Ｈ１２６，Ｅ１２７，Ｋ１２９；组１０：Ｐ３５，Ｑ３６，Ｅ６０，Ｇ６１，Ｐ６３，Ｆ６４，Ｋ６５，Ｙ６６；其前提条件是：重组Ｂｅｔｖ１过敏原不是下述特定突变体：（Ａｓｎ２８Ｔｈｒ，Ｌｙｓ３２Ｇｌｎ，Ａｓｎ７８Ｌｙｓ，Ｌｙｓ１０３Ｖａｌ，Ａｒｇ１４５Ｇｌｕ，Ａｓｐ１５６Ｈｉｓ，＋１６０Ａｓｎ）；（Ｔｙｒ５Ｖａｌ，Ｇｌｕ４２Ｓｅｒ，Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ，Ａｓｎ７８Ｌｙｓ，Ｌｙｓ１０３Ｖａｌ，Ｌｙｓ１２３Ｉｌｅ，Ｌｙｓ１３４Ｇｌｕ，Ａｓｐ１５６Ｈｉｓ）；（Ｔｙｒ５Ｖａｌ，Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ，Ｌｙｓ６５Ａｓｎ，Ｌｙｓ９７Ｓｅｒ，Ｌｙｓ１３４Ｇｌｕ）；（Ａｌａ１６Ｐｒｏ，Ａｓｎ２８Ｔｈｒ，Ｌｙｓ３２Ｇｌｎ，Ｌｙｓ１０３Ｔｈｒ，Ｐｒｏ１０８Ｇｌｙ，Ｌｅｕ１５２Ｌｙｓ，Ａｌａ１５３Ｇｌｙ，Ｓｅｒ５５Ｐｒｏ）；（Ｎ２８Ｔ，Ｋ３２Ｑ，Ｎ７８Ｋ，Ｋ１０３Ｖ，Ｐ１０８Ｇ...

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：J霍尔姆，M弗雷拉斯，
申请(专利权)人：阿尔克阿贝洛有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]