色谱双层颗粒制造技术

本发明专利技术是一种生产色谱分离基质的方法，其中在两相体系中制备包含具有不同性质的两层的多孔聚合物颗粒，包括：（ａ）提供表面上具有反应性基团的多孔聚合物颗粒；（ｂ）用第一种溶剂洗涤所述颗粒并沥干颗粒，从而密封第一相；（ｃ）通过加入基本上不溶于第一种溶剂的第二种溶剂来润湿密封的颗粒外层；（ｄ）通过加入一种基本上在第一种溶剂中是非反应活性的试剂，使外层上的反应性基团反应；和（ｅ）使色谱结合基团偶联到内层的反应性基团上。本发明专利技术还包含适合用作色谱分离基质的多孔聚合物颗粒，以及一种分离方法，其中使用了根据本发明专利技术的基质。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用作色谱基质的多孔聚合物颗粒的生产方法，该颗粒包含具有不同性质的两层。本专利技术还涉及上述颗粒以及使用了上述颗粒的色谱方法。
技术介绍
术语色谱法包含了一系列密切相关的分离方法。上述方法均是基于将互不混溶的两相接触的特征，其中一相是固定的而另一相是流动的。色谱法可用于从污染化合物中纯化液体或者从液体中回收一种或多种产物。近年来，其中色谱法引起巨大兴趣的一个领域是生物
，例如用于新药大规模且经济的生产和诊断。而且，近年来蛋白质的纯化变得越加重要，这是由于蛋白质组学领域的开发，其中研究了由人类基因组表达的蛋白质的功能。一般地，蛋白质是通过细胞培养生产的，其要么在细胞内要么被分泌到周围介质中。因为所用的细胞系是活的机体，所以必须向它们供给包含糖类、氨基酸、生长因子等的复杂的生长介质。要从供给细胞的化合物混合物中和从细胞自身的副产物中分离所需的蛋白质使其达到足够的纯度，例如用作人类的治疗剂，这给人们提出了一个艰巨的挑战。通常，细胞和/或细胞碎片已经通过过滤去除。一旦已经获得含有所需蛋白质的澄清溶液，通常利用不同色谱技术的组合进行该蛋白质与该溶液的其它组分的分离。这些技术基于蛋白质的电荷、疏水性程度、亲和性、大小等来分离蛋白质混合物。对于这些技术的每一种，可获得多种不同的色谱基质，从而允许针对所涉及的特定蛋白质来设计纯化方案。为了减少从细胞培养物或裂解物中获得产物所需步骤的数目，已经提出了改进的色谱技术。例如，在已知的膨胀床色谱技术中已经进行了避免去除细胞和/或细胞碎片步骤的尝试。膨胀床色谱是非填充床技术，其中基质优选呈颗粒形状，通过供应向上流动的流体使得基质呈流化或膨胀状态。随后将包含待分离化合物的溶液引入该流体中。(对于膨胀床色谱的举例说明性用途，参见例如国际专利申请WO98/33572(Amersham Pharmacia Biotech AB))。实验结果显示，在上述膨胀床中，原则上允许细胞通过该床，同时所需的化合物被吸附到该颗粒适当的配体上。但是，在离子色谱中会出现问题，在这种情况下细胞表面和基质的结合基团带有相反的电荷。随后产生聚集，这可以导致膨胀床的塌陷以及诱导蛋白质产量的减少。用于分离蛋白质和相似化合物的改进的可利用方法的另一种选择是通过改善基质材料的方法。为此，已经建议了具有一种以上官能团及由此可以选择性地吸附一种以上化合物的基质。因此，美国专利第5,522,994号公开了一种从样品中分离两种不同大小分子的方法，其中使用的分离介质具有至少两种不同类型的官能团。这种介质可以通过用大小改性剂处理孔中具有反应性基团的多孔材料而制得，该大小改性剂仅渗入该多孔材料的某些孔中。从而，该改性剂将仅仅化学改性渗入孔中的反应性基团。为了提供具有不同性质的分离介质，WO 98/39094公开了位阻效应的另一种用途。在该种情况下，多孔基质的表面覆盖有聚合物，该聚合物所具有的分子量足以使其不能渗入基质的微孔体系。优选地，孔中的基质本身为用葡聚糖衍生的琼脂糖并且任选地被官能化。覆盖表面的聚合物的例子还可以是具有更大分子量的葡聚糖、纤维素等。在一些情况下，覆盖表面的聚合物在附着于基质上之前已经被官能化。因而，聚合物表层的目的是为了在空间上阻止大于某一大小的化合物穿过内部的微孔。通过提供所具有的官能团不同于微孔体系中存在的官能团的聚合物，可以建立一种体系，其中吸入微孔中的较小化合物避免了被吸附在表面上的聚合物上。所公开的基质可用于分离核酸、蛋白质和其它有机的和无机的化合物。WO 98/39364描述了一种在多孔的基质层上引入第二种官能团的方法。该方法的实现是通过将所述基质与一种试剂接触，该试剂以比其扩散入所述基质更高的反应速率与基质表面上的配体反应。反应性通常受溶剂、pH等的影响，并且向基质的扩散作用取决于基质和试剂的化学性质。因此，该方法得到了一种基质，其中原始的配体仍然存在于内孔体系中，而加入的试剂则在外层上提供了另一种官能团。从而，外层的厚度将取决于加入的试剂的数量。优选的基质是琼脂糖，并且该试剂可以是根据常规方法的溴。专利技术概述本专利技术的一个目的是提供生产用于色谱基质的颗粒的选择性的方法，其中该颗粒包含具有不同性质的明确的两层。该方法可以利用一种两相体系来实施，其中仅在其中一相中反应的试剂被用于改性该色谱基质的外层。本专利技术的另一个目的是提供一种生产包括两层的色谱颗粒的方法，该方法避免了将涂敷聚合物施加到该颗粒表面的需要。这可以通过一种方法实现，即其中两层均由一种相同的材料制备并且利用两相体系，该两相体系在化学改性内孔体系期间保护外层或者在化学改性外层期间保护内孔体系。本专利技术的再一个目的是提供一种生产包括具有不同性质的两层的色谱颗粒的方法，所述层由一种相同的材料制备，并且不需要添加临界量的试剂和不需要确定该试剂的扩散和反应速率。这可以通过一种方法实现，即其中该颗粒的外层通过与一种试剂反应而被保护，该试剂在该颗粒的内相不具有化学反应活性。因而，可以在不影响保护的表面外层的情况下，进行官能团与内层的连接。本专利技术的另一个目的是提供适于用作色谱基质的颗粒，该颗粒易于制备并且在吸附过程中，该颗粒能选择性地吸附一种需要的化合物到结合基团上，从而在空间上阻止了与大分子如细胞或细胞碎片的接触。这可以通过提供包含具有不同性质的两层的颗粒而实现，其中整个颗粒由一种材料构成并且在外层存在非官能化的表面。本专利技术的具体目的是提供如上所述的颗粒，在色谱吸附过程中该颗粒能排斥大分子。这可以通过包括明确的两层颗粒来实现，其中该颗粒的外层已经被改性并且具有能化学排斥大分子的基团，例如带负电荷的基团。本专利技术的再一个目的是提供一种膨胀床吸附(EBA)方法，其中减少或甚至消除了细胞和细胞碎片的聚集作用。这可以通过利用本专利技术的颗粒而实现，该颗粒的外层上具有带负电荷的基团，从而可排斥细胞、细胞碎片和核酸。本专利技术的上述以及其它目的在所附的权利要求书中会获得更加具体的限定。通过下面详细的描述将清楚地说明本专利技术进一步的实施方式和优点。附图简介附图说明图1是根据本专利技术的两相体系的示意图，该两相体系用于氧化颗粒表面上的烯丙基。图2是颗粒的示意图，该颗粒具有中性的，即非官能的外层和由本专利技术方法制备的配体-官能化的内部或内层。专利技术详述本专利技术的第一方面是一种色谱分离基质的生产方法，其中在两相体系中制备包含具有不同性质的两层的多孔聚合物颗粒，包括(a)提供至少一种多孔聚合物颗粒，在该颗粒的孔表面和外表面上存在反应性基团；(b)用第一种溶剂洗涤所述的颗粒并沥干颗粒，从而密封第一相；(c)通过加入基本上不溶于第一种溶剂的第二种溶剂来润湿密封的颗粒外层，获得在外层中的第二相；(d)通过加入一种基本上在第一种溶剂中是非反应活性的试剂，使外层上的反应性基团反应；和(e)使色谱结合基团偶联到内层的反应性基团上。在本文中，在步骤(b)密封的颗粒部分被命名为该颗粒的“内层”，而“外层”是指该颗粒的剩余部分。当在本文中讨论到外层表面时，应当理解为包括了外表面以及其孔体系的表面。在优选的实施方案中，反应性基团是碳-碳双键，例如烯丙基、乙烯基等，在该种情况下，所述试剂可以是氧化剂。但是，可以设想的其它反应性基团是羟基、氨基、羧基、巯基等。实施步骤(b)中的沥干是为了本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产色谱分离基质的方法，其中在两相体系中制备包含具有不同性质的两层的多孔聚合物颗粒，包括：　　　　（ａ）提供至少一种多孔的聚合物颗粒，在该颗粒的孔表面和外表面上存在反应性基团；　　　　（ｂ）用第一种溶剂洗涤所述颗粒并沥干颗粒，从而密封第一相；　　　　（ｃ）通过加入基本上不溶于第一种溶剂的第二种溶剂润湿密封的颗粒外层，获得在外层的第二相；　　　　（ｄ）通过加入一种基本上在第一种溶剂中是非反应活性的试剂，使外层上的反应性基团反应；和　　　　（ｅ）使色谱结合基团偶联到内层中的反应性基团上。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：H贝里，P布松，M卡尔松，
申请(专利权)人：通用电气健康护理生物科学股份公司，
类型：发明
国别省市：SE[瑞典]