检测氯霉素的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测氯霉素的试剂盒。本发明专利技术所提供的检测氯霉素的试剂盒，包括酶标氯霉素及包被的氯霉素特异性抗体。本发明专利技术的检测氯霉素的试剂盒能同时快速检测大批样品；主要试剂均以工作液形式提供，使用方便；具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度等特点，可在动物性食品氯霉素残留检测中发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及酶联免疫和兽药残留检测分析
中的一种检测氯霉素的试剂盒。
技术介绍
氯霉素(chloramphenicol，CAP)是应用广泛的抗菌素，在畜禽疾病控制和治疗中起到了重要作用。但由于氯霉素存在严重的副作用，能抑制骨髓细胞内线粒体的蛋白质合成，造成骨髓细胞和肝细胞的毒性，从而引起人的再生性障碍性贫血，粒细胞缺乏症，新生儿、早产儿灰婴综合症等疾病，欧美等发达国家已相继禁止或严格禁止使用。2002年12月中国农业部公告第235号文规定，氯霉素及其盐、酯(包括琥珀氯霉素)在所有食品动物的所有可食组织中不得检出。但由于氯霉素价格便宜且为广谱抗生素，违法使用仍很普遍。因此加强对动物性食品中氯霉素的残留检测是非常必要的。目前，常用于氯霉素残留检测的方法主要有微生物法和仪器分析法。微生物检测法虽然经济、操作简便，但在样本中有其他微生物抑制剂存在时，其灵敏度和特异性受到限制；高效液相色谱分析法、气谱、气质联机法等单纯的仪器分析方法，虽然灵敏度高，但是样本前处理及测定操作烦琐，费用高，不适宜于大量样本筛查，可以作为残留的确证分析。免疫化学法，尤其是酶联免疫吸附测定法(ELISA)其灵敏度比微生物法高，样品前处理又比仪器分析法简单，特别适于现场监控和大量样本筛查。专利技术创造内容本专利技术的目的是提供一种检测氯霉素的试剂盒。本专利技术所提供的检测氯霉素的试剂盒，包括酶标氯霉素及包被的氯霉素特异性抗体。其中，所述氯霉素特异性抗体可为氯霉素单克隆抗体或氯霉素多克隆抗体，所述氯霉素单克隆抗体或多克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源和豚鼠源抗体，所述氯霉素单克隆抗体优选为氯霉素鼠单克隆抗体，所述氯霉素多克隆抗体优选为氯霉素兔多克隆抗体。以上抗体均可以用氯霉素与载体蛋白的偶联物作为免疫原按常规方法制备。所述载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)或血兰蛋白(KLH)等常用载体蛋白。所述标记酶可为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，优选为辣根过氧化物酶。可作为固定所述氯霉素特异性抗体的载体的物质很多，如聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等。该载体的形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等。为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括氯霉素标准溶液、显色剂、终止液、浓缩洗涤液和浓缩复溶液。所述浓缩洗涤液为含有0.8-1.2％吐温的磷酸盐缓冲液；所述显色剂由显色液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，所述显色液B液为邻苯二胺(OPD)或四甲基联苯胺(TMB)；所述浓缩复溶液为含有0.8-1.2％吐温的柠檬酸盐缓冲液。本专利技术的检测原理为将氯霉素特异性抗体作为包被原吸附于固相载体上，加入样品和酶标氯霉素，待测样品中残留的氯霉素和酶标氯霉素竞争固相载体上包被的氯霉素特异性抗体，显色后终止，测定样品吸光值，该值与样品中氯霉素残留量呈负相关，与标准曲线比较即可得出氯霉素的含量。同时根据酶标板上的样品颜色的深浅，与系列浓度的氯霉素标准溶液颜色的比较可判断样品的浓度范围。本专利技术的检测氯霉素的试剂盒主要采用直接竞争ELISA方法定性或定量检测动物组织(猪、鸡、牛、羊的肌肉组织及肝脏、鱼虾等)、尿样、血清血浆、饲料、蜂蜜、牛奶等样品中氯霉素的残留量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品；该试剂盒采用高特异性的氯霉素单克隆抗体或多克隆抗体，主要试剂均以工作液形式提供，使用方便，具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度等特点，可在动物性食品氯霉素残留检测中发挥重要作用。附图说明图1为检测氯霉素的试剂盒的结构示意图具体实施方式实施例1、抗原及抗体的制备(1)酶标抗原的合成将氯霉素和辣根过氧化物酶进行偶联，得到辣根过氧化物酶标记的氯霉素。(2)免疫原的合成将氯霉素和牛血清白蛋白(BSA)采用活化酯法进行偶联得到免疫原。(3)氯霉素鼠单克隆抗体制备动物免疫程序采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以氯霉素与牛血清白蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为80-100μg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2-3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞。细胞融合与克隆化取免疫BALB/c小鼠脾细胞，按5-10∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。细胞冻存和复苏取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成1-5×106个/ml的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。单克隆抗体的制备与纯化采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7-14天后腹腔注射杂交瘤细胞5×105-106个/只，7-10天后采集腹水。经辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，-20℃保存。(4)氯霉素兔多克隆抗体的制备采用新西兰大白兔作为免疫动物，以氯霉素与牛血清白蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为1mg/kg·b.w.，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3-4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫7-10d后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。实施例2、检测氯霉素的试剂盒(1)检测氯霉素的试剂盒的结构试剂盒的结构如图1所示，主要由盒体1、铝膜真空包装96孔/40孔酶标板2、6瓶氯霉素系列浓度标准品3、终止液4、酶标记物工作液5、底物显色液A液6、底物显色液B液7、浓缩洗涤液8、浓缩复溶液9和泡沫托架10，泡沫托架10上制有凹孔，上述试剂瓶3-9安放在泡沫托架的凹孔内，泡沫托架10及酶标板2安放在盒体内。其中酶标板2由塑料支架和可拆分的塑料条组成。(2)所用试剂的配制a.氯霉素标准溶液∶氯霉素系列标准溶液6瓶，0、0.01、0.25、2.5、5.0、10.0ng/ml，1-3ml/瓶。b.包被缓冲液pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液。c.封闭液3-10％小牛血清。d.浓缩洗涤液含0.8-1.2％吐温的磷酸盐缓冲液(0.01M pH7.4)，为正常使用浓度的15-25倍，30-50ml/瓶，1瓶。e.酶标记物工作液酶标氯霉素工作液，5-8ml/瓶，1瓶。f.底物显色液A液过氧化氢或过氧化脲，5-8ml/瓶，1瓶。g.底物显色液B液邻苯二胺(OPD)或四甲基联苯胺(TMB)，5-8ml/瓶，1瓶。h.终止液1-2mol/L硫酸或盐酸，5-8ml/瓶，1瓶。i.浓缩复溶液含0.8-1.2％吐温的柠檬酸盐缓冲液，为正常使用浓度的5-10倍，30-50ml/瓶，1瓶。(3)酶标板的制备用包被缓冲液将氯霉素特异性抗体稀释成0.1-1μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h，4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤3次，每次1min，拍干，然后在每孔中加入150-200μl封闭液，37本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测氯霉素的试剂盒，包括酶标氯霉素及包被的氯霉素特异性抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈建忠，史为民，魏书林，张素霞，丁双阳，江海洋，刘金凤，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]