Ｈｅｉｎｚ（１９８０）借助腺苷脱氨酶将腺苷脱氨产生次黄苷，通过次黄苷偶联嘌呤核苷磷酸化酶和黄嘌呤氧化酶酶促反应生成过氧化氢，在过氧化氢酶和醛脱氢酶的作用下，测量３３４ｎｍ处ＮＡＤＰＨ吸光度上升的速率来测算腺苷脱氨酶活性。该法缺点是试剂成本过高。本发明专利技术引入Ｔｒｉｎｄｅｒ氏反应，将次黄苷偶联酶促反应生成的过氧化氢在过氧化物酶的作用下使苯胺类供氢体和４－氨基安替比林偶联物凝聚成有色产物。通过连续反应和动态观察有色产物的产量，从而测定腺苷脱氨酶的活性。本发明专利技术简化了Ｈｅｉｎｚ氏测定腺苷脱氨酶的次黄苷偶联酶促反应体系，降低了试剂成本。本发明专利技术将苯胺类化合物ＡＤＯＳ、ＡＤＰＳ、ＡＬＰＳ、ＴＯＤＢ、ＴＯＯＳ和ＴＯＰＳ用作Ｔｒｉｎｄｅｒ氏反应的供氢体，增加了反应的灵活性。本发明专利技术还涉及用于进行上述方法的试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生物样本中测定腺苷脱氨酶活性的技术方案以及有此方案制造的试剂。特别是涉及一种有腺苷脱氨酶将腺苷脱氨产生次黄苷后偶联多酶促反应体系。
技术介绍
Heinz(1980)借助腺苷脱氨酶(Adenosine deaminase，ADA)将腺苷(Adenosine)脱氨产生次黄苷(Inosine)。通过次黄苷偶联嘌呤核苷磷酸化酶(Purine nucleoside phosphorylase，PNP)和黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase，XOD)酶促反应生成过氧化氢(H2O2)。过氧化氢酶(Catalase)将过氧化氢还原成水，在乙醇(Ethanol)存在条件下生成乙醛(Acetaldehyde)。乙醛依赖NADP+被醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase)氧化，同时NADP+被还原成NADPH。通过测量334nm处NADPH吸光度上升的速率来测算ADA活性。该法缺点是反应体系过于繁琐、试剂成本高，阻碍临床推广使用。其反应原理和参考文献如下 Heinz F，Reckel S，Pilz R，Kalden JR.嘌呤代谢酶的新分光光度计测定法IV。测定腺苷脱氨酶。酶。1980；25(1)50-5。Trinder(1969)利用供氢体N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-3-甲基苯胺和偶联物4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine，4-AA)在过氧化物酶(Peroxidase，POD)的氧化作用下被过氧化氢(H2O2)凝聚生成紫红色的有色醌(Quinone dye)。有色醌最大吸收光谱在545-556nm处。通过测量556nm处有色醌吸光度上升的速率来测算POD活性。该法缺点是供氢体的选择过窄，仅选用EHSPT。其反应原理和参考文献如下 P.Trinder，用葡萄糖氧化酶和一种新型氧受体来测定血糖。临床生化年刊，卷6，24-26页，1969。
技术实现思路
Heinz氏测定腺苷脱氨酶的次黄苷偶联酶促反应体系过于繁琐，尤其是过氧化氢酶、醛脱氢酶和NADP+的使用造成试剂成本高，阻碍临床推广使用。Trinder氏反应仅选用EHSPT作为供氢体，不利于反应的灵活应用。本专利技术将次黄苷偶联PNP和XOD酶促反应以及Trinder氏反应联合使用。使XOD氧化下产生的H2O2通过Trinder氏反应将苯胺类供氢体和4-氨基安替比林偶联物凝聚成有色产物。通过连续反应和动态观察有色产物的产量，从而测定腺苷脱氨酶的活性。本专利技术用Trinder氏反应代替了Heinz氏次黄苷偶联酶促反应法中过氧化氢酶和醛脱氢酶反应步骤。从而简化了Heinz氏法测定腺苷脱氨酶的次黄苷偶联酶促反应体系、省去了昂贵的过氧化氢酶、醛脱氢酶和NADP+成分、大大降低了试剂成本，为ADA测试法的产业化和市场化开辟了一条新路。本专利技术对Trinder氏反应也进行了改进。将以下任一苯胺类化合物用作Trinder氏反应的供氢体。从而增加了反应的灵活性，使腺苷脱氨酶测定的整套反应体系更有利于临床推广使用。1)N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-3-甲氧基苯胺2)N-乙基-N-(3-硫丙基)-3-甲氧基苯胺3)N-乙基-N-(3-硫丙基)苯胺4)N，N-双(4-硫丁基)-3-甲基苯胺5)N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-3-甲基苯胺 6)N-乙基-N-(3-硫丙基)-3-甲基苯胺以本专利技术的次黄苷偶联酶促反应配制了测定ADA的试剂盒。具体实施例方式1.确定Adenosine Michaelis常数Km1)试剂组成试剂I Trizma-base缓冲液pH 7.650毫摩尔/升(mmol/L)4-AA 2mmol/LADA300单位/升PNP100U/LXOD200U/LPOD600U/L试剂II Tris-HCl缓冲液pH 4.0 50mmol/LAdenosine 0.001-10mmol/LTOOS 2mmol/L2)试验参数与操作步骤温度37℃波长550纳米(nm)比色杯光径 1.0厘米(cm)测试方法速率法反应方向正予孵育 1.8毫升(ml)试剂I予孵育时间 3分钟启动反应加0.9ml试剂II延迟时间5分钟测试时间3分钟测试仪 Shimadzu UV-1603)计算计算出测试时间段每分钟平均吸光度的变化(ΔA/min)。ΔA/min=(ΔA1/min+ΔA2/min+ΔA3/min)3]]>4)结果以ΔA/min作为反应速率V，用1/V作为Y轴，Adenosine浓度S的倒数1/S作为X轴。作Lineweaver-Burke图。求得Adenosine Km 3.53×10-5mol/L。2.确定有色产物毫摩尔消光系数ε1)试剂组成试剂ITrizma-base缓冲液pH7.6 50mmol/L4-AA 2mmol/LADA300U/L(牛肠) PNP100U/LXOD200U/LPOD600U/L试剂II Tris-HCl缓冲液pH4.0 50mmol/LAdenosine 3mmol/LADOS或ADPS或ALPS 2mmol/L或TODB或TOPS或TOOS2)试验参数与操作步骤温度37℃波长265nm(Adenosine)比色杯光径 1.0cm测试方法速率法反应方向负予孵育 1.8ml试剂I予孵育时间 3分钟启动反应加0.9ml试剂II延迟时间2.5小时测试仪 Shimadzu UV-160动态观察1mmol/L Adenosine吸光度下降至2.5小时后完全降解。然后，在以下波长测定有色产物的吸光度542nm (ADOS)540nm (ADPS)561nm (ALPS)630nm (TODB)630nm (TOPS)550nm (TOOS)3)结果ε毫摩尔消光系数 在本法条件下供氢体ADOS氧化凝聚产物ε＝27.2mM-1cm-1ADPS氧化凝聚产物ε＝27.9mM-1cm-1ALPS氧化凝聚产物ε＝41.3mM-1cm-1TODB氧化凝聚产物ε＝22.5mM-1cm-1TOPS氧化凝聚产物ε＝22.5mM-1cm-1TOOS氧化凝聚产物ε＝32.2mM-1cm-13.苯胺类供氢体化合物的选择1)试剂组成试剂ITrizma-base缓冲液pH7.6 50mmol/L4-AA 2mmol/LPNP 100U/LXOD 200U/LPOD 600U/L试剂II Tris-HCl缓冲液pH4.050mmol/LAdenosine10mmol/L ADOS或ADPS或ALPS2mmol/L或TODB或TOPS或TOOS2)生物样本0-600U/L牛肠ADA。3)试验参数与操作步骤温度37℃波长542nm (ADOS)540nm (ADPS)561nm (ALPS)630nm (TODB)630nm (TOPS)550nm (TOOS)比色杯光径 1.0cm测试方法速率法反应方向正予孵育 0.05ml样本+1.8ml试剂I予孵育时间 3分钟启动反应加0.9ml试剂II延迟时间5分钟测试时间3分钟测试仪 Shima本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测定生物样本中腺苷脱氨酶活性的方法，其特征是借助腺苷脱氨酶将腺苷脱氨产生次黄苷，通过次黄苷偶联嘌呤核苷磷酸化酶和黄嘌呤氧化酶酶促反应生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下使苯胺类供氢体和４－氨基安替比林偶联物凝聚成有色产物，通过连续反应和动态观察有色产物的产量，从而测定腺苷脱氨酶的活性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡枫，
申请(专利权)人：浙江亚克药业有限公司，蔡枫，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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