高密度脂蛋白中的胆固醇的检测方法及试剂技术

高密度脂蛋白中胆固醇的检测方法，其特征在于检测样本与胆固醇酯水解酶及胆固醇氧化酶，或是与胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶及胆固醇脱氢酶，在含有胆汁酸衍生物的水性介质中反应，测定生成的过氧化氢或还原性辅酶。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及检测样本中高密度脂蛋白(以下简称为HDL)中胆固醇的检测方法、检测试剂、检测试剂盒、新的胆汁酸衍生物以及新的胆汁酸衍生物的制备方法。
技术介绍
机体中的脂蛋白根据其比重的不同，可分为高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(以下简称为LDL)、极低密度脂蛋白(以下简称为VLDL)、乳糜微粒(以下简称为CM)，他们主要由于脱辅基蛋白种类的不同而在机体中的作用大不一样，脂质组成也各不相同。其中，HDL与消除为了从包括动脉壁的各组织获取胆固醇而在细胞内积聚的胆固醇的作用有关，是冠状动脉硬化症以及其他各种动脉硬化症的危险预防因子，它在血中的含量水平被认为是判断动脉硬化疾病发病先兆的有效指标。以往HDL中胆固醇(以下简称为HDL胆固醇)的检测方法是由超离心法、免疫化学方法、电泳法、沉淀法等进行和级分和胆固醇定量这两个步骤组成。但是，级分这一步骤，操作繁琐费时，安全性也无法保证。因此，与这些分离一起进行的检测方法效率极低，不够实用。近年来，人们开发了各种检测方法以求解决上述问题。比如使HDL以外的脂蛋白凝聚的检测方法，其中包括用使硫酸葡聚糖等使HDL以外的脂蛋白凝聚的试剂、2价金属盐以及经过化学修饰的酶的检测方法(特开平8-131197公报)，还有使用聚阴离子等与HDL以外的脂蛋白形成络合物的试剂、不能溶解聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合物等脂蛋白的表面活性剂的检测方法(特开平8-201393号公报)，以及使用硫酸葡聚糖等聚阴离子、2价金属盐、特殊的非离子性表面活性剂以及不同于样品中白蛋白的其他白蛋白的检测方法(特开平9-285298号公报)等。另外还有，将血清或血浆用含有脂蛋白分离剂(硫酸葡聚糖等聚阴离子和镁离子的组合物)的溶液进行处理，得到的混合液不经固体和液体分离处理，在有阴离子性表面活性剂(烷基磺酸或胆汁酸或其衍生物)存在的条件下，与胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶反应，测定生成的过氧化氢，以此过程为特征的血清或血浆中HDL胆固醇的检测方法(特开平8-116996号公报)。但是，这些使HDL以外的脂蛋白凝聚的HDL胆固醇测定法尽管与以往的标准法有良好的相关性，但会产生一些问题，如反应生成的凝聚物形成的混浊会导致无法准确测定，反应池进行碱清洗时和反应液中的金属盐反应生成金属氢氧化物，它的析出使自动分析装置超负荷。另外也有不使HDL以外的脂蛋白凝聚的测定法，如用酰基聚氧乙烯山梨糖醇酐酯将HDL以外的脂蛋白优先转换成过氧化氢、除去生成的过氧化氢后加入聚氧乙烯烷基醚、然后对HDL胆固醇进行酶测定的方法(特开平9-299号公报)，还有将机体样本、来源于胰脏的胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和胆酸等胆汁酸在有白蛋白存在的条件下进行接触、然后测定HDL胆固醇和该酶反应所消耗或生成的化合物，以此过程为特征的HDL胆固醇测定方法(国际公开第97/40376号文件)等。但是，采用这些不使HDL以外的脂蛋白凝聚的HDL胆固醇测定法，会由于HDL以外脂蛋白中的胆固醇未完全除去、或是发生对HDL以外的脂蛋白中胆固醇的非特异反应而导致测定值不准确的问题。采用胆汁酸类的HDL胆固醇测定法除了如上述特开平8-116996号公报和国际公开97/40376号文件中记载的方法外，另外还有的方法是将血清或血浆置于含有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和胆汁酸或胆汁酸衍生物或磺基琥珀酸二辛酯的缓冲液中与该酶反应，将VLDL和LDL中的胆固醇先行反应成为HDL胆固醇，测定生成的过氧化氢，然后在反应液中添加含非离子性聚氧乙烯氧化物基团的表面活性剂，使HDL胆固醇与该酶反应，特异性地单独定量HDL胆固醇(特开昭62-69999号公报)，有的方法是将血清在特定的pH值和特定的温度下、在含有来源于胰脏的胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、胆汁酸类表面活性剂和非离子性表面活性剂的缓冲液中与该酶反应，从而来测定HDL胆固醇(特开昭63-126498号公报)；有的方法是将机体样本在白蛋白和胆汁酸或其盐存在的条件下与来源于胰脏的胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶接触，使HDL胆固醇与该酶反应，处理后的机体样本再与微生物来源的胆固醇酯酶接触，使LDL胆固醇与该酶(微生物来源的胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶)反应，从而来测定HDL胆固醇和LDL胆固醇(特开平11-9300号公报)；还有的方法是将含有脂蛋白的样本在胆汁酸衍生物和/或两性表面活性剂存在的条件下与酶(胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶)反应，使其选择性地与HDL胆固醇反应，再在反应液中加入含有聚氧乙烯链的非离子型表面活性剂，使其选择性地与LDL胆固醇反应，从而来测定HDL胆固醇和/或LDL胆固醇(特开2000-325097号公报)，等等。但是，这些测定法有时测定时间很长，而且也并不一定能特异性地检测HDL胆固醇。在酯的部位具有氧化乙烯基的酯以前已有发表(特开平5-221941号公报)，但还没有人发现用该酯进行HDL胆固醇测定的方法。酯化合物的合成方法，一般比较简便的方法是通过羧酸和醇的缩合反应进行合成，尤其常用的是利用酸催化剂的共沸酯化法。但是，由于化合物具有体积大的取代基或水溶性基团，从而造成收率低的结果(C.K.Ingold著，《有机化学的结构和机理(Structure andMechanism in Organic Chemistry)》(英国)，第2版，Bell 1969年，15章，1128-1178页)。比如在上述的特开平5-221941号公报中记载的合成方法是用对甲苯磺酸作为酸催化剂、使胆酸和二甘醇一甲醚发生反应得到胆酸酯，但是即使经过72小时的长时间加热回流，胆汁酸酯的收率还是非常低，只有23％，而且后处理操作还非常繁琐复杂。另外，如果用分子内带有羟基的羧酸则也会不断进行自我酯化，因此也有的方法是将分子内的羟基保护起来，与醇进行酯化反应。比如，有的方法用熊脱氧胆酸和2-羟基乙氧基葡萄糖苷进行熊脱氧胆酸酯的合成(特开平11-199598号公报)，但此方法因为包含1)熊脱氧胆酸的羟基用TBDMS(叔丁基二甲基甲硅烷)保护的步骤、2)酯化步骤以及3)脱保护基(脱TBDMS基)步骤，所以不能说是一种简便的合成方法。专利技术的公开本专利技术的目的在于提供简便准确地检测样本中高密度脂蛋白中的胆固醇的方法以及此检测方法所用的检测试剂和试剂盒。本专利技术涉及以下～。高密度脂蛋白中胆固醇的检测方法，其特征在于检测样本与胆固醇酯水解酶及胆固醇氧化酶，或是与胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶及胆固醇脱氢酶，在含有胆汁酸衍生物的水性介质中反应，测定生成的过氧化氢或还原性辅酶。如记载的方法，其中水性介质还含有白蛋白。如或记载的方法，其中胆固醇酯水解酶表示经过化学修饰的胆固醇酯水解酶。如记载的方法，其中化学修饰过的胆固醇酯水解酶表示胆固醇酯水解酶经过选自主要成分为聚乙二醇的基团、主要成分为聚丙二醇的基团、含有聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物的基团、含有水溶性多糖类的基团、磺基丙基、磺基丁基、聚氨酯基以及具有螯合作用的基团中的基团的修饰。如记载的方法，其中化学修饰过的胆固醇酯水解酶是胆固醇酯水解酶经过以聚乙二醇为主要成分的基团的修饰。如～任何一项记载的方法，其中胆汁酸衍生物是具有阴离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物。如记载的方法，其中具有阴离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物是选自胆酸或其盐、牛磺本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：片山有基，藤中真由美，森山聪，村田繁，
申请(专利权)人：协和梅迪克斯株式会社，
类型：发明
国别省市：