诊断家畜血吸虫病斑点金渗滤试剂盒其制备及应用方法技术

本发明专利技术提供了一种诊断家畜血吸虫病斑点金渗滤试剂盒其制备及应用方法，属新型的免疫标记技术和家畜血吸虫病免疫学诊断技术。本发明专利技术将胶体金直接标记在日本血吸虫抗原蛋白质上，适用于牛、羊、猪、兔等多种动物血吸虫病抗体的检测；在应用时仅需将被检家畜血样干纸浸出液，点在硝酸纤维素膜上作为固定相，再滴加血吸虫抗原胶体金２～３滴（１００～１５０μｌ），２分钟内即形成肉眼可见的红色斑点，结果判断容易，一个反应盒可做４份待检血样，降低了检测成本，提高了效率，具有敏感、特异、检出率高，省工、省时、成本低等优点。与粪孵血吸虫毛蚴法相比，阳性符合率达１００％，阴性符合率９９．２％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及家畜血吸虫病的诊断
，尤其涉及家畜血吸虫病斑点金免疫渗滤诊断试剂盒及其制备方法与应用方法。
技术介绍
家畜血吸虫病既危害家畜健康，又是其病源的重要散播者。随着我国血防工作的深入开展，虽已取得较大成绩，但目前我国尚有100多个县(市、区)未能控制该病传播，同时在已基本消灭家畜血吸虫病的省、地区也仍有长期巩固与监测的任务。若采用常规粪孵血吸虫毛蚴法检测，需要投入较大的人力、物力和资金；现有的血清学诊断家畜血吸虫病方法有IHA法、ELISA法，但其检测时间长，单个样品检测需要0.5～3小时，而且这些方法中均含有潜在致癌物质的酶显色底物。要完成国务院提出的“到2015年底，力争全国所有未控制血吸虫病流行的县(市、区)达到血吸虫病传播控制标准”，急需有新的诊断技术支撑，因此寻找一种快速、简便，适用于家畜血吸虫病流行病学调查、普查、诊断、流通市场现场检疫的方法，已成为防疫部门迫切希望解决的问题。目前，在诊断人血吸虫病的方法中尚有金标法，丁建祖等浙江省医学科学院寄生虫病研究所快速检测日本血吸虫抗体的金标免疫渗滤法的建立及应用 中国寄生虫病防治杂志 1998 11(4)308；沈丽英等浙江省医学科学院寄生虫病研究所 血吸虫抗体金标免疫诊断试剂盒的研制 中国公共卫生2000 16(3)244；张素娥等 浙江省医学科学院寄生虫病研究所 金标抗rSjc26GST多克隆抗体斑点免疫金渗滤法检测血吸虫循环抗原的研究 中国血吸虫病防治杂志 2000 12(5)265；干小仙等 浙江省医学科学院寄生虫病研究所 金标渗滤法快速检测血吸虫循环抗原的现场应用研究 中国人畜共患病杂志 2000 16(2)19该技术是将胶体金标记在兔抗人IgG或者兔抗血吸虫虫卵多抗或者GST-PcAb上作为探针和显色剂，将血吸虫可溶性虫卵抗原或血吸虫重组蛋白多抗包被在硝酸纤维素膜上作为捕捉抗体，组成双夹心DIGFA(金标免疫渗滤法)。检测时在测试盒的硝酸纤维素膜上滴加100μl待检人血清，再用金标探针显色的一种免疫学检测方法。该法存在的主要问题是需要制备血吸虫重组蛋白多抗或者兔抗人IgG或者兔抗血吸虫虫卵多抗或者GST-PcAb，制备这些专一多抗周期长，手续繁杂，成本很高，限制了它们在普查家畜血吸虫病中推广应用。而且在制备胶体金标记的探针时，通常以试管目测法确定多抗的用量，为了保证充分包被，避免多余胶体金与非特异蛋白结合而干扰检测结果判断，一般在此基础上再增加10％～20％的多抗的用量，然后又为了去除多余的游离多抗，又需要进行层析或高速离心等纯化处理，这些处理或者对设备条件要求很高，或者处理过程周期长，步骤繁杂，因此成本均高，不利于产业化开发；三是由于该法以捕捉多抗为固相，以待测血清和胶体金探针为流动相，所以一块反应盒仅能检测1个人的血样，其检测成本较高而效率较低；同时其含有包被抗原或多抗的硝酸纤维素膜的测试盒需在4～8℃的条件下贮藏，对大面积推广应用增加了难度；四是反应步骤多，带来的干扰也相对增多。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述不足之处，提供一种敏感、特异、结果可靠、成本低廉、检测效率较高的家畜血吸虫病诊断试剂盒；本专利技术的另一目的是提供该试剂盒中血吸虫抗原胶体金的简便、省本、省时的制备方法；本专利技术的第三个目的是提供一套应用该试剂盒对家畜血吸虫病进行简便，快速，准确的诊断方法。本专利技术斑点金免疫渗滤法的基本原理是一种采用硝酸纤维素膜为家畜待检血样的固相载体，以亲和层析原理为基础，抗原胶体金结合物为液相，并同时作为探针和指示剂，而建立起来的一种新型的免疫检测方法。其中胶体金颗粒的表面带负电荷与血吸虫抗原蛋白分子的正电荷基团因静电作用形成牢固的结合，同时金颗粒又有高电子密度的特性，当这些被标记的抗原与相应的抗体配体大量聚集时，便形成肉眼可见的红色斑点。本专利技术的目的是通过下述技术方案予以实现的。一种诊断家畜血吸虫病斑点金渗滤试剂盒，包括盒体、内置反应盒、黑色试剂瓶、生理盐水瓶(内装有0.85％生理盐水)及玻璃毛细管(内径1mm)及标准阳性血纸、阴性血纸；其中所述反应盒由盒底、盒盖组成的塑料小盒，盒盖中央有一直径0.8cm的小圆孔，盒内装满吸水垫料，紧贴盒盖小圆孔内放一层1.1×1.1cm硝酸纤维素膜(孔径为0.45μ或0.65μ)，紧闭盒盖即成反应盒；所述黑色试剂瓶内装有血吸虫抗原胶体金。一种制备上述诊断家畜血吸虫病斑点金渗滤试剂盒的方法，所述盒体、黑色试剂瓶、生理盐水瓶及玻璃毛细管均为常规实验用品；所述黑色试剂瓶内装有的血吸虫抗原胶体金按以下原料比例与工艺步骤制备而成(1)、胶体金的制备 胶体金以1％氯金酸、1％柠檬酸三钠、1％鞣酸、25mMK2CO3及双蒸水为原料，先将1％氯金酸与双蒸水按体积比1∶79配成A液；再将1％柠檬酸三钠、1％鞣酸、25mMK2CO3与双蒸水按体积比4∶0.03～0.15∶0.03～0.15∶15.70～15.94配成B液；将配制好的A液、B液在水浴内同时加热到59～61℃，在电磁搅拌器上搅拌A液，快速加入B液，继续搅拌1分钟，在10～13分钟内加热至沸腾，氯金酸在鞣酸-柠檬酸钠还原剂的作用下，使金离子还原成金原子，其液体颜色由黑→蓝→紫→红色，此时合成的胶体金颗粒直径R＝8～12nm，较稳定，在4℃下可保存13个月。(2)血吸虫可溶性抗原与纯化抗原的制备 将日本血吸虫卵置玻璃研磨器中研磨后，用0.85％NaCl溶液按重量配成5％浓度溶液，置-25℃反复冻融7次，用40KHz、400W超声波探头浸入溶液内处理20分钟，在4℃下以13000rpm离心60分钟，吸取上清液为血吸虫可溶性抗原；将可溶性抗原经葡聚糖凝胶G200分离纯化，将其中有活性的第I峰与II峰合并作为血吸虫纯化抗原；再将该可溶性抗原及纯化抗原分别装入透析袋，用双蒸水进行透析去除盐分后，即成合格的包被用的血吸虫可溶性抗原与血吸虫纯化抗原。(3)胶体金pH值的调整 胶体金与血吸虫抗原的结合在等电点的条件下最稳定，因此，胶体金液在被血吸虫抗原包被前，需用0.25MK2CO3调整胶体金液的pH值为7.15～7.2，才能使胶体金与血吸虫抗原牢固地结合。(4)血吸虫抗原包被胶体金 按体积重量比每100ml胶体金液与血吸虫可溶性抗原1.16～1.52mg或与血吸虫纯化抗原0.58～0.76mg混合进行包被，搅拌10分钟后，依次加入适量的10％叠氮钠、10％牛血清白蛋白和10％聚乙二醇，搅匀后1500rpm/min离心30分钟，吸收红色上清液，即成血吸虫抗原胶体金，并按量分装于黑色试剂瓶内封口，保存。上述血吸虫抗原胶体金制备方法的一种优选方案是，其中所述配制胶体金的B液的组分与含量为1％柠檬酸三钠4.0ml、1％鞣酸0.09ml、25mMK2CO30.09ml、双蒸水15.82ml；制成的胶体金颗粒直径为10＜D≤11nm；胶体金液pH值调为7.20；包被胶体金液的抗原采用血吸虫可溶性抗原，胶体金液与抗原的体积重量比为100ml∶1.30mg。一种应用上述诊断家畜血吸虫病斑点金渗滤试剂盒诊断家畜血吸虫病的方法，具体是按以下步骤操作(1)待检家畜干燥血纸血样的采取 采取动物耳静脉血2～5滴/头，滴于纸面，阴凉干燥，备本文档来自技高网...

【技术保护点】
诊断家畜血吸虫病斑点金渗滤试剂盒，包括盒体、内置反应盒，黑色试剂瓶、生理盐水瓶、玻璃毛细管及标准阳性血纸、阴性血纸，其特征是所述反应盒由盒底、盒盖组成的塑料小盒，盒盖中央有一直径０．８ｃｍ圆孔，盒内装满吸水垫料、紧贴盒盖圆孔内放一层１．１×１．１ｃｍ硝酸纤维素膜，紧闭盒盖即成反应盒；所述黑色试剂瓶内装有血吸虫抗原胶体金。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张雪娟，卢福庄，方兰勇，冯尚连，项美华，程菊芬，周永学，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]