一种检测前列腺癌患者外周血循环肿瘤细胞AR-V7蛋白表达的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供了一种检测前列腺癌患者外周血循环肿瘤细胞AR‑V7蛋白表达的试剂盒及检测方法，所述的试剂盒包括稀释液、脱色液、染色液A、染色液B、鼠抗人AR‑V7一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗、0.1%Triton X‑100、0.3%H

【技术实现步骤摘要】
一种检测前列腺癌患者外周血循环肿瘤细胞AR-V7蛋白表达的试剂盒及检测方法
本专利技术提供了一种检测前列腺癌患者外周血循环肿瘤细胞AR-V7蛋白表达的试剂盒及检测方法，属于分子生物学

技术介绍
在世界范围内，前列腺癌发病率居男性恶性肿瘤第2位，癌症特异性死亡居第6位。2015中国肿瘤登记年报显示，2011年中国前列腺癌发病率居恶性肿瘤第9位，城市男性前列腺癌的发病率和死亡率在男性恶性肿瘤中分别居第6位和第9位。前列腺癌治疗的难点是转移性前列腺癌，尤其是内分泌治疗后出现的去势抵抗现象，目前转移性前列腺癌去势抵抗后的治疗手段有限，并且会出现所有的常规治疗手段（放疗、化疗、内分泌治疗、靶向治疗）都失效的情况。随着分子生物学的发展，中晚期前列腺细胞癌的免疫治疗逐渐兴起，初步的临床试验也取得了较好的疗效，目前多项III期临床试验正在开展。AR-V7（AndrogenReceptorVariant-7）是雄激素受体（AR）的一种剪切变异体，在没有配体（如睾酮和双氢睾酮）存在的情况下，也能通过与AR形成异二聚体启动AR的核转位，继而刺激雄激素轴相关下游靶基因的转录表达。检测患者组织中AR-V7蛋白表达水平可以简单、准确的预测接受阿比特龙或恩杂鲁胺的mCRPC患者的治疗结果：AR-V7蛋白表达水平高的患者口服阿比特龙效果差。但是对于转移性去势抵抗前列腺癌患者，很少有机会获得转移病灶的病理组织。循环肿瘤细胞（Circulatingtumorcell，CTC）是从实体肿瘤脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液态活检”。针对目前临床实践中，前列腺癌患者AR-V7检测的标本主要为肿瘤组织，来源于手术或穿刺活检，很难做到多次或实时检测。因此，检测循环肿瘤细胞(CTC)AR-V7表达情况对前列腺癌预后及免疫治疗疗效评估具有重要价值。目前，山东省第一医科大学、山东省药物研究院联合山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司等单位，对于循环肿瘤细胞检测鉴定关键技术进行产业化推广的研究，本项目为山东省重大科技创新工程项目，本项目将以山东第一医科大学济南校区的山东省药物研究院为核心，落实注册人制度，依托循环肿瘤细胞检测鉴定核心诊断技术，进一步注册鉴定诊断试剂盒，以包括PD1、PD-L1、ER、PR、Her-2、GPC-3、VEGF、P53、Vimentin、TKI-EGFR、RAS、CK、ALK-D5F3、CD20、ALK/EML4、Beta-catenin、E-Cadherin、EP-CAM、HPV、IDH-1、PSA、PSMA、VEGF、GFAP、细胞角蛋白、AE1/AE3、雌激素受体、孕激素受体、BCA-225、CA125、CEA、EMA、ERCC1、HPV、Ki-67、P53、TOP2A等作为CTCs表达的示踪剂，注册超灵敏、超快速、高覆盖、低成本、准确特异的鉴定诊断试剂盒，通过与在济南注册的山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司合作进行产业化推广。
技术实现思路
针对现有技术中的检测肿瘤晚期或复发前列腺癌患者无法实时或反复穿刺获取组织标本、进而不能评估患者AR-V7实时动态状态，及现有检测方法容易出现假阳性和假阴性的缺点，本专利技术提供了一种检测前列腺癌患者外周血循环肿瘤细胞AR-V7蛋白表达的试剂盒及检测方法：利用膜过滤装置分离获得晚期前列腺癌患者外周血中的循环肿瘤细胞（CTC），进一步运用免疫组化技术检测CTC上AR-V7表达情况。本专利技术通过以下技术方案实现：一种检测前列腺癌患者外周血循环肿瘤细胞AR-V7蛋白表达的试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A0.5mL、染色液B1mL、鼠抗人AR-V7一抗100μL、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗100μL、0.1%TritonX-100100μL、0.3%H2O2100μL、试剂A1mL。优选地，所述稀释液为1mmol/LEDTA+0.1%BSA+0.3%硫酸铁+0.5%蔗糖。优选地，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按体积比1:1组成。优选地，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。优选地，所述试剂A为乙醇和多聚甲醛按照体积比3：1组成。本专利技术中，利用所述的试剂盒非诊断目的检测前列腺癌患者外周血循环肿瘤细胞AR-V7蛋白表达的方法，包括以下步骤：（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发前列腺癌患者外周血：采集无法获取组织标本的晚期或复发前列腺癌患者肘正中静脉外周血5ml；（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；（4）过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入染色液B液1ml，染色2min，纯水1ml冲洗2次，取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC；（5）运用免疫组化技术检测外周血CTC的AR-V7蛋白表达情况。优选地，步骤（5）所述检测外周血CTC的AR-V7蛋白表达的具体方法如下：（1）脱色：将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液；（2）滴加100μl0.1%TritonX-100，室温孵育15min，DI水洗2min×3次；（3）滴加100μl0.3%H2O2，室温孵育10min，PBS洗2min×3次；（4）滴加100μl鼠抗人AR-V7一抗，室温孵育2h或4℃过夜，PBS洗2min×3次；（5）滴加100μl辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，18～26℃温度下孵育20min，PBS洗2min×3次；（6）滴加100μlDAB显色液，18～26℃孵育并随时在显微镜下观察显色情况，观察时间为3～10min；（7）显色完成后，弃掉DAB显色液，流水冲洗5min，苏木素染色5min；（8）盐酸酒精分化8秒，自来水返蓝5min；（9）将返蓝后的CTC采用75%乙醇（1min），95%乙醇（1min），100%乙醇（1min）梯度乙醇脱水，然后加入1mL试剂A，摇动混合均匀后，离心沉淀，将沉淀物采用中性树脂封固；（10）光学显微镜下镜检。本专利技术所使用的膜过滤分离循环肿瘤细胞装本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测前列腺癌患者外周血循环肿瘤细胞AR-V7蛋白表达的试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A 0.5mL、染色液B 1mL、鼠抗人AR-V7一抗100μL、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗100μL、0.1% Triton X-100 100μL、0.3% H

【技术特征摘要】
1.一种检测前列腺癌患者外周血循环肿瘤细胞AR-V7蛋白表达的试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A0.5mL、染色液B1mL、鼠抗人AR-V7一抗100μL、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗100μL、0.1%TritonX-100100μL、0.3%H2O2100μL、试剂A。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液为1mmol/LEDTA+0.1%BSA+0.3%硫酸铁+0.5%蔗糖。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按体积比1:1组成。


4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。


5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂A为乙醇和多聚甲醛按照体积比3：1组成。


6.一种利用权利要求1-5任一项所述的试剂盒非诊断目的检测前列腺癌患者外周血循环肿瘤细胞AR-V7蛋白表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发前列腺癌患者外周血：采集无法获取组织标本的晚期或复发前列腺癌患者肘正中静脉外周血5ml；
（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；
（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；
（4）过滤结束后...

【专利技术属性】
技术研发人员：王焕昇，李胜，李浩，高德海，
申请(专利权)人：山东第一医科大学山东省医学科学院，
类型：发明
国别省市：山东;37