一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供了一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞PD‑L1表达的试剂盒及检测方法，所述的试剂盒包括稀释液、脱色液、染色液A、染色液B、抗人PD‑L1一抗、酶标羊抗人二抗1、0.1%Triton X‑100、0.3%H

【技术实现步骤摘要】
一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的试剂盒及检测方法
本专利技术提供了一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的试剂盒及检测方法，对晚期肝细胞癌患者应用PD-1抑制剂免疫治疗提供实时动态临床指导，属于分子生物学

技术介绍
肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高，在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃、食道而居第三位；在部分地区的农村中居第二位，仅次于胃癌。我国每年死于肝癌约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45％，肝癌平均患病年龄44岁。肝癌病理分型为肝细胞癌、胆管细胞癌、混合型肝癌，其中肝细胞癌占70-80%，其恶性程度高，发展迅速，若治疗不及时或治疗方案选择不当，平均生存时间为半年左右。肝细胞癌早期无症状，一旦出现明显症状，约有1/3已属晚期，患者会感到肝区胀痛，尤其饭后为甚，厌食，肝大，右上腹肿块，不明原因的消瘦、腹胀、腹泻、间断性发热、乏力、食欲减退等，严重影响人类寿命及生活质量。目前随着分子生物学的发展，中晚期肝细胞癌的免疫治疗逐渐兴起，初步的临床试验也取得了较好的疗效，目前多项III期临床试验正在开展，以PD-1/PD-L1为免疫靶点的免疫疗法为肝细胞癌治疗带来了新的曙光。研究发现，免疫抑制与免疫逃逸和肿瘤细胞PD-L1的过表达密切相关，肿瘤细胞可通过其表面的PD-L1与免疫细胞T细胞表面的PD-1结合，传导抑制性信号，使得T细胞不能识别肿瘤细胞和向肿瘤细胞发出攻击信号，导致了肿瘤细胞免疫逃逸。PD-1或PD-L1免疫制剂的疗效多与肿瘤组织中PD-L1的免疫组化表达水平有关，提示PD-L1表达水平可能是预测PD-1免疫治疗疗效的生物标志物；还有研究表明肝细胞癌组织中PD-L1的高表达与肿瘤侵袭性呈正相关。但晚期或复发肝细胞癌患者无法实时或反复穿刺获取组织标本、进而不能评估患者PD-L1实时动态状态。循环肿瘤细胞（Circulatingtumorcell，CTC）是从实体肿瘤脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液态活检”。经文献检索发现，目前乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌应用不同的检测方法对循环肿瘤细胞(CTC)PD-L1表达检测有少量报道，但肝细胞癌循环肿瘤细胞PD-L1的检测国内外均未见报道。因此，检测循环肿瘤细胞(CTC)PD-L1表达情况对肝细胞癌患者预后及免疫治疗疗效评估具有重要价值。
技术实现思路
针对现有技术中晚期或复发肝细胞癌患者无法实时或反复穿刺获取组织标本、进而不能评估患者PD-L1实时动态状态的缺点，本专利技术提供了一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的试剂盒及检测方法：利用膜过滤装置分离获得晚期肝细胞癌患者外周血中的循环肿瘤细胞（CTC），进一步运用免疫组化技术检测CTC中PD-L1表达情况。本专利技术通过以下技术方案实现：一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的试剂盒，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A0.5mL、染色液B1mL、抗人PD-L1一抗100μL、酶标羊抗人二抗100μL、0.1%TritonX-100100μL、0.3%H2O2100μL、试剂A1mL。优选地，所述稀释液为1mmol/LEDTA+0.1%BSA+0.3%硫酸铁+0.5%蔗糖。优选地，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按体积比1:1组成。优选地，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。优选地，所述试剂A为乙醇和多聚甲醛按照体积比3：1组成。本专利技术中，所述的试剂盒非诊断目的检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发肝细胞癌患者外周血：采集患者肘正中静脉外周血5ml；（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；（4）过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入染色液B液1ml，染色2min，纯水1ml冲洗2次，取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC；（5）运用免疫组化技术检测外周血CTC的PD-L1表达情况。优选地，步骤（5）所述检测外周血CTC的PD-L1表达的具体方法如下：（1）脱色：将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液；（2）滴加100μl0.1%TritonX-100，室温孵育15min，DI水洗2min×3次；（3）滴加100μl0.3%H2O2，室温孵育10min，PBS洗2min×3次；（4）滴加100μl抗人PD-L1一抗，室温孵育2h或4℃过夜，PBS洗2min×3次；（5）滴加100μl酶标羊抗人二抗，18～26℃温度下孵育20min，PBS洗2min×3次；（6）滴加100μlDAB显色液，18～26℃孵育并随时在显微镜下观察显色情况，观察时间为3～10min；（7）显色完成后，弃掉DAB显色液，流水冲洗5min，苏木素染色5min；（8）盐酸酒精分化8秒，自来水返蓝5min；（9）将返蓝后的CTC采用75%乙醇（1min），95%乙醇（1min），100%乙醇（1min）梯度乙醇脱水，然后加入1mL试剂A，摇动混合均匀后，离心沉淀，将沉淀物采用中性树脂封固；（10）光学显微镜下镜检。本专利技术所使用的膜过滤分离循环肿瘤细胞装置，包括滤器、血样容器、废液缸和铁架台，所述铁架台设有底座、立架和支架，所述血样容器通过支架设置于铁架台上部，血样容器的下方为滤器，滤器通过输液器联通至废液缸，废液缸设置于底座上。所述滤器包括滤器上口、滤膜、载滤膜平台和滤器下口，滤膜置于载滤膜平台上；滤器上口接血样容器，滤器下口通过输液器接废液缸。所述滤膜为疏水材料制成，其上均匀布满口径为8微米的滤孔；肿瘤细胞直径一般大于15微米，而血细胞（包括红细胞、白细胞）直径一般小于8微米，因此当含有CTC的外周血经过滤后，血细胞因直径小于滤孔的能够被滤过，而CTC因直径大于滤孔被截留在滤膜上。有益效果（1）本专利技术提供的检测方法，不用穿刺活检获取组织标本即可检测到晚期或复发肝细胞癌患者PD-L1表达情况，利用微创技术，能够实现实时动态检测；（2）本专利技术提供的方法，循环肿瘤细胞分离好，能本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A 0.5mL、染色液B 1mL、抗人PD-L1一抗100μL、酶标羊抗人二抗100μL、0.1% Triton X-100 100μL、0.3% H

【技术特征摘要】
1.一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A0.5mL、染色液B1mL、抗人PD-L1一抗100μL、酶标羊抗人二抗100μL、0.1%TritonX-100100μL、0.3%H2O2100μL、试剂A1mL。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液为1mmol/LEDTA+0.1%BSA+0.3%硫酸铁+0.5%蔗糖。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按体积比1:1组成。


4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。


5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂A为乙醇和多聚甲醛按照体积比3：1组成。


6.一种利用权利要求1-5任一项所述的试剂盒非诊断目的检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发肝细胞癌患者外周血：采集患者肘正中静脉外周血5ml；
（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；
（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；
（4）过滤结束后，从膜过滤分离...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔凯，李胜，李浩，马莹，戚元刚，
申请(专利权)人：山东省肿瘤防治研究院山东省肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：山东;37