生物发光提高的发光蛋白质制造技术

嵌合发光蛋白质，其通过将奥贝林蛋白质所包含的位于第一个和第二个钙结合位点之间的区域用选自Ｃｌｙｔｉｎ、水母发光蛋白、Ｔｈａｌａｓｓｉｃｏｌｉｎ、Ｍｉｔｏｃｒｏｍｉｎ、Ｍｎｅｍｉｏｐｓｉｎ和Ｂｅｒｏｖｉｎ的发光蛋白质中的相应区域进行替代而获得。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供了发光活性提高的嵌合发光蛋白质，提供了其在报告基因系统中作为钙指示物的用途以及在用于检测和测定胞内钙的基于细胞的测定法中作为钙指示物的用途。
技术介绍
生物发光是活的生物体通过多种化学发光发应系统发射可见光的能力。生物发光反应需要三种主要的成分萤光素、萤光素酶和分子氧。然而在一些反应中也需要包括阳离子(Ca++和Mg++)和辅因子(ATP、NAD(P)H)的其他成分。萤光素酶为催化底物萤光素氧化并产生不稳定中间体的酶。光在不稳定中间体衰变成基态产生氧化萤光素时发射。虽然存在多种不同的无关萤光素类型，但是来自至少七个门的许多物种使用相同的萤光素，即已知的腔肠素(coelenterazine)，其含有由三个氨基酸(2个酪氨酸和1个苯丙氨酸)形成的环。萤光素/萤光素酶系统可在一些动物(如水母)中以稳定的“发光蛋白质”形式提取，其在结合钙时能发光。发光蛋白质与萤光素酶不同，因为前者为萤光素酶和萤光素的稳定氧化中间复合体。发光蛋白质在许多海洋腔肠动物中存在并允许这些生物为包括繁殖、摄食和防御在内的多种目的发光(1)。虽然细菌能连续发光，但发光在许多其他生物中以闪光的形式出现，一般地持续时间为0.1-1秒。这需要酶促反应的迅速开/关且存在适当螯合并易于快速动员的反应物。在腔肠动物中闪光由钙的进入引起。发光蛋白质的钙结合位点与钙调素同源。发光蛋白质在钙存在的条件下通过分子内反应发出可见光。虽然有许多发光生物，但目前只有七种发光蛋白质得到分离，即Thalassicolin(2，3)、水母发光蛋白(4-6)、Mitrocromin(与Halistaurin为同物异名词)(7，8)、Clytin(与Phialidin为同物异名词)(8，9)、奥贝林(Obelin)(2，6，10，11)、Mnemiopsin(12，13)和Berovin(12，13)。这些蛋白全部为脱辅基蛋白质、咪唑吡嗪发色团(腔肠素)和氧的复合体。其结构高度保守，尤其在包含三个钙结合位点(EF手型结构)的区域。这些EF手型结构为钙结合蛋白家族的特点。发光蛋白质一旦和与EF手型袋紧密结合的钙反应就会发光。反应为单次周转事件并造成CO2的释放和在蓝光区域发光(λmax＝470nm)。术语“发光蛋白质”等同于与萤光素结合的多肽，其能发光，而“脱辅基发光蛋白质”用于表示不具萤光素的蛋白质。研究最多的发光蛋白质为从维多利亚多管水母(Aequorea vicoria)分离的水母发光蛋白(14)和从双叉薮枝螅(Obelia longissima)分离的奥贝林(15)。当与Ca++结合时，水母发光蛋白经历将其转换成加氧酶(萤光素酶)的构象变化，然后通过结合的分子氧催化腔肠素的氧化。蓝色荧光蛋白由不与脱辅基发光蛋白质共价连接的coelenteramide组成，其为腔肠素的氧化产物。发光蛋白质可通过将脱辅基发光蛋白质与腔肠素、分子氧、EDTA和2-巯基乙醇或二硫苏糖醇孵育而重新产生。既然腔肠素为发光蛋白质水母发光蛋白、Mitrocomin、Clytin和奥贝林使用的共同发光底物，那么这四种发光蛋白质中的发光反应可能是相同的(16)。最近获得的水母发光蛋白和奥贝林的一级结构和晶体学数据带来了有关其功能的其他信息。来源于螅体双叉薮枝螅的天然奥贝林为含有非共价连接的发色团腔肠素的、具有分子量约为20kDa的由195个氨基酸残基(aa)组成的单链蛋白质。对Clytin一级结构的分析表明其含有189个氨基酸残基并属于发光蛋白质家族。然而水螅Ca++结合发光蛋白质与其他的Ca++结合蛋白质如钙调素和肌钙蛋白C不同，前者具有相对高含量的半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、脯氨酸和酪氨酸残基。对奥贝林结构和功能的研究在Bondar VS等，Biochemistry(2001)，66(9)1014-8，Vysotski ES等，(2003)，42(20)6013-24和Deng L.等，FEBSLett.(2001)，506(3)281-5中报道。后两者尤其描述了W92F奥贝林突变体的生物发光和发射性质。发光蛋白质广泛用于报告基因技术中来监测与信号转导和基因表达相关的细胞事件。对细胞事件和其调节的研究需要灵敏的、非侵害性的分析方法。发光蛋白质和通常的生物发光为极好的报告系统，因为其与荧光系统相比实质上不具有背景。已经在哺乳动物细胞中表达了发光蛋白质以监测对不同刺激反应的钙变化。胞内钙浓度可通过向表达发光蛋白质的哺乳动物细胞中加入腔肠素辅因子并探测光子发射来测定，其中所述光子发射为胞内钙浓度的指示物。专利技术详述现在发现将奥贝林蛋白质(脱辅基奥贝林)所包含的、位于前两个钙结合位点之间的区域用选自C1ytin、水母发光蛋白、Thalassicolin、Mitocromin、Mnemiopsoin和Berovin的发光蛋白质中的相应区域进行替代的嵌合，可获得生物发光提高的新发光蛋白质。如在此使用的，奥贝林可指从包括双叉薮枝螅水母和曲膝薮枝螅(Obelia geniculata)在内的不同种类薮枝螅中分离的任一发光蛋白质(17)。奥贝林核苷酸和氨基酸序列参考分别列于SEQ ID NO.1和2中。Clytin、Mitocromin和水母发光蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列参考存于GenBank登录号Q08121、P39047、AAA27720和分别地L13247、L31623、L29571，而Thalassicolin、Mnemiopsis和Berovin的序列在参考文献2、3、12和13中描述。正如在此使用的，“相应的区域或片段”是指在所选择发光蛋白质中的任一这样的氨基酸序列，其在分别的序列比对中除了至少1个、优选地除了至少5个、更优选地除了至少10个氨基酸残基外与奥贝林序列匹配，并在相关蛋白质(奥贝林和所选发光蛋白质)中不保守，在涉及奥贝林序列时，所述的区域或片段优选地跨越42-112位残基，更优选地跨越50-95位残基。根据本专利技术优选的实施方案，嵌合蛋白质可通过用Clytin序列从53到97位残基的片段替代奥贝林氨基酸序列的50到94位残基来获得。这样获得的命名为“Photin”的发光蛋白质具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列。本专利技术的嵌合蛋白质可进一步通过一个或多个氨基酸残基的删除、添加或替代来修饰，条件是使发光蛋白质涉及发光和钙反应性的活性特征得以维持或提高。在涉及奥贝林序列时，尤其优选的为在55、66、67、73、74、75、78、83、84、87、89和94位替代。体外研究表明，Photin产生对钙刺激产生强烈的生物发光，一般其高于在天然发光蛋白质中观察到的生物发光。为制备嵌合发光蛋白质，可使用常规的基因工程制备具有奥贝林和所选的非奥贝林发光蛋白质的部分编码序列的重组DNA构建体，将得到的嵌合产物插入载体，在适当的宿主中表达，然后分离和纯化。例如编码奥贝林和不同发光蛋白质的cDNA可通过PCR扩增或用合成寡核苷酸在体外构建，产物可利用适当的限制酶切位点重组，其中所述酶切位点为天然存在或人工引入寡核苷酸中用于PCR或体外构建。除了重组构建体之外，表达载体还可含有启动子、核糖体结合位点、起始密码子、终止密码子或转录增强子的共有位点。载体还可包含用于分离含有DNA构建体的宿主细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：M·福蒂，S·洛默尔，
申请(专利权)人：阿克萨姆有限公司，
类型：发明
国别省市：