一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异的引物及试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异的引物及试剂盒。本分明基于高通量测序技术，能够快速、全面、准确地检测BRAF基因T1799A、A1801G突变，TERT基因C228T、C250T突变，RET基因T2753C突变，EIF1AX基因G25C/A/T、G370T、G371T突变和TP53基因G818A突变。这些基因的上述位点突变与甲状腺癌的预后密切相关。因此使用本发明专利技术对患者的样本进行检测，可以协助医生对甲状腺癌患者的预后情况进行评估和判断，对医生选择合适的手术方式以及有针对性地制定术后随访方案提供有价值的决策依据和参考信息，有助于提高甲状腺癌患者的治疗效果及生存质量，具有非常重要的临床价值。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异的引物及试剂盒
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异的引物及试剂盒。
技术介绍
甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤。根据GLOBOCAN2018的数据，全球甲状腺癌的发病人数占全部恶性肿瘤的3.1%，占女性恶性肿瘤的5.1%。自20世纪70年代以来，全世界大部分地区，包括美国、加拿大、欧洲、澳大利亚、亚洲和南美洲部分地区，均报道了甲状腺癌发病率的迅速上升和相对稳定的死亡率。根据中国癌症中心的统计数据显示，我国女性甲状腺癌的发病率位居女性所有恶性肿瘤的第4位。甲状腺癌可分为乳头状癌、滤泡状癌、髓样癌和未分化癌，其中乳头状癌和滤泡状癌预后较好，未分化癌预后最差。但也有研究表明，部分甲状腺乳头状癌和滤泡状癌患者的预后也比较差，不同的基因发生突变可能是影响其预后质量的关键因素。随着分子生物学技术的进展，分子诊断在甲状腺癌预后评估中的作用和价值，逐渐受到人们的关注。BRAF基因突变和TERT基因突变是甲状腺癌预后不良的重要指标。无论BRAF基因T1799A或TERT基因C228T/C250T单独还是同时发生突变，患者的无复发生存率均明显下降。但BRAF基因A1801G突变则是甲状腺滤泡型腺瘤或滤泡型甲状腺乳头状癌（FollicularVariantsofPapillaryThyroidCarcinoma，FVPTC）中的特有突变。临床数据证实，和BRAF基因T1799A突变不同的是，BRAF基因A1801G突变往往是患者预后较好的指标之一。此外，RET基因T2753C突变也与甲状腺癌患者的预后差有显著相关。相比于RET基因野生型患者，RET基因T2753C突变患者更容易发生远端转移，无转移生存期缩短，生存率显著降低。携带EIF1AX基因G25C/A/T、G370T或G371T突变的甲状腺癌患者，其预后也较EIF1AX基因野生型患者差，易发生远端转移，易出现疾病复发。此外，TP53基因G818A突变，也是甲状腺癌的重要致病突变，且很多的在未分化甲状腺癌中被检出，这部分患者的预后普遍较差。目前检测基因突变，常用的检测方法包含，一代测序（Sanger测序）法、扩增阻滞突变系统PCR（ARMS-PCR）法、数字PCR（dPCR）法等。Sanger测序法是基因检测的“金标准”，能够直接检测不同碱基突变信号，结果分析方便，但是该方法的检测灵敏度较低，无法检出低水平的突变，且操作步骤多，耗时长。ARMS-PCR法对于多基因多位点的检测，往往需要进行多管反应，耗时耗力。dPCR法适用于低拷贝量样本，低频突变样本的检测，但是操作过程较多，操作对结果影响较大，而且耗材成本高，通量小。因此，我们专利技术了一种基于高通量测序（NGS测序）法，能快速、全面、准确地检测一组甲状腺癌预后相关基因的多个变异位点的引物组合及试剂盒。通过对一组甲状腺癌预后相关的基因变异进行检测，其检测结果可以用来协助医生对甲状腺癌患者的预后情况进行评估和判断，对医生选择合适的手术方式以及有针对性地制定术后随访方案提供有价值的决策依据和参考信息，有助于提高甲状腺癌患者的治疗效果及生存质量，具有非常重要的临床价值。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种基于二代测序技术的能快速、全面、准确地检测甲状腺癌预后相关基因变异的引物及试剂盒，为评估甲状腺癌预后情况提供良好的辅助作用。使用本专利技术方法，可以同时检测5个基因上的9个突变位点，所述9个突变位点分别如表1所示：表1基因名称和突变位点表具体的，本专利技术提供了一种能够特异性扩增甲状腺癌预后相关基因变异的引物组合，包括如下扩增引物对：核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的BRAF基因的扩增引物对，核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的TERT基因的扩增引物对，核苷酸序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的RET基因的扩增引物对，核苷酸序列如SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示的EIF1AX基因的扩增引物对，核苷酸序列如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示的TP53基因的扩增引物对，核苷酸序列如SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示的通用扩增引物对。特异性多重PCR引物序列见表2所示。表2引物序列表其中，SEQIDNO.13中的M和SEQIDNO.14中的N分别为6个随机碱基序列，index编号不同，这6个碱基序列也不同，用于区分不同样品。本专利技术还提供了一种检测甲状腺癌预后相关基因变异的试剂盒，所述试剂盒包含：特异性多重PCR引物、NGS建库试剂、阳性对照、阴性对照、无核酸酶水。NGS建库试剂为本领域常规使用试剂，能够从市场购买。优选地，所述NGS建库试剂可以选择市售二代测序快速DNA建库试剂盒（Illumina）。优选地，所述阳性对照为BRAF基因T1799A突变的人类基因组DNA储存液。优选地，所述阴性对照为经确认不包含本专利技术所述基因变异的健康人类基因组DNA储存液。所使用的样本为肿瘤患者的实体组织。优选地，所用的样本为可以是新鲜手术组织和/或穿刺组织、冷冻手术组织和/或穿刺组织、福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的组织样本中的一种或多种。更优选地，检测样本为新鲜手术组织和/或穿刺组织。一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异的试剂盒，其检测流程包括如下步骤：(1)样本提取：使用DNA样本抽提试剂盒提取样本中的DNA；(2)多重PCR扩增：用特异性多重PCR引物与NGS建库试剂中的扩增试剂，对从步骤（1）中获得的DNA进行扩增；(3)产物纯化：在步骤（2）获得的PCR扩增产物中加入定量的磁珠，进行纯化，去除基因组DNA和残余扩增引物；(4)接头连接：在步骤（3）获得的纯化产物中加入NGS建库试剂中的特异性标签和接头试剂，进行反应；(5)文库纯化：在步骤（4）所获得的已加上标签序列的小片段文库中加入磁珠，进行纯化，去除大片段和残余接头；(6)文库检测：将步骤（5）制备好的文库用Qubit进行定量，并用AgilientBioanalyzer2100进行质检，检测文库的浓度以及文库的片段大小，确保最终文库片段在300bp左右；(7)上机测序：将步骤（6）检测合格的文库用Illumina测序平台进行高通量测序；(8)生信分析：对测序结果用生物信息软件进行分析和注释。优选的，所述核苷酸序列SEQIDNO.1～12所示的DNA特异性引物混合池浓度为10μM。所述核苷酸序列SEQIDNO.13～14所示的通用引物混合池浓度为10μM。所述PCR扩增产物纯化使用的磁珠为BeckmanAgencourtAMPureXP磁珠。本专利技术的有益效果是：（1）本专利技术提供了一种可以同时检测BRAF基因、TERT基因、RET基因、EIF1AX基因及TP53基因上的9个常见突变位点本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异的引物组合，其特征在于，所述引物组合由以下特异性多重PCR引物对组成：/nBRAF：F-GCTCTTCCGATCTTCTTCATAATGCTTGCTC；/nBRAF：R-GCTCTTCCGATCTTAACTCAGCAGCATCTC；/nTERT：F-GCTCTTCCGATCTACGTGGCGGAGGGAC；/nTERT：R-GCTCTTCCGATCTCGGTAGTGGCTGCGCAGC；/nRET：F-GCTCTTCCGATCTGCACTCCTCTGGTTAC；/nRET：R-GCTCTTCCGATCTCATGAAGGCCCCTCAGTG；/nEIF1AX：F1-GCTCTTCCGATCTCTTAATTTCATTTTATTTCATAC；/nEIF1AX：R1-GCTCTTCCGATCTCGTAATTTATGAAAACAC；/nEIF1AX：F2-GCTCTTCCGATCTTGATGAAACTTTGAGTAAATTAC；/nEIF1AX：R2-GCTCTTCCGATCTTAGGGGAAAGTTGGTTTCTCCA；/nTP53：F-GCTCTTCCGATCTAAGGCAGGGGTATTTGTTTTGATGC；/nTP53：R-GCTCTTCCGATCTTCCTACCAGGAAGAACCGGC；/nI5XX：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；/nI7XX：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[i7]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT。/n...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异的引物组合，其特征在于，所述引物组合由以下特异性多重PCR引物对组成：
BRAF：F-GCTCTTCCGATCTTCTTCATAATGCTTGCTC；
BRAF：R-GCTCTTCCGATCTTAACTCAGCAGCATCTC；
TERT：F-GCTCTTCCGATCTACGTGGCGGAGGGAC；
TERT：R-GCTCTTCCGATCTCGGTAGTGGCTGCGCAGC；
RET：F-GCTCTTCCGATCTGCACTCCTCTGGTTAC；
RET：R-GCTCTTCCGATCTCATGAAGGCCCCTCAGTG；
EIF1AX：F1-GCTCTTCCGATCTCTTAATTTCATTTTATTTCATAC；
EIF1AX：R1-GCTCTTCCGATCTCGTAATTTATGAAAACAC；
EIF1AX：F2-GCTCTTCCGATCTTGATGAAACTTTGAGTAAATTAC；
EIF1AX：R2-GCTCTTCCGATCTTAGGGGAAAGTTGGTTTCTCCA；
TP53：F-GCTCTTCCGATCTAAGGCAGGGGTATTTGTTTTGATGC；
TP53：R-GCTCTTCCGATCTTCCTACCAGGAAGAACCGGC；
I5XX：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；
I7XX：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[i7]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT。


2.根据权利要求1所述的引物组合在制...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宇清，宣涛，王宇，
申请(专利权)人：润安医学科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32