T7EI-like核酸酶反应缓冲体系、DNA错配检测方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种T7EI‑like核酸酶反应缓冲体系、DNA错配检测方法及应用，涉及一种T7EI‑like核酸酶的反应缓冲溶液配方，以及利用该缓冲体系增强该类核酸酶错配识别切割能力的应用。常规的反应缓冲体系中，T7EI‑like核酸酶对插入缺失(InDel)导致的错配DNA具有较好的识别切割能力，而对单核苷酸多态性(SNP)导致的错配DNA的识别切割能力较差；本发明专利技术的反应缓冲体系中，T7EI‑like核酸酶对两类错配DNA均有良好的识别切割能力。该反应缓冲体系的核心在于其特定的缓冲溶质配比、去垢剂浓度、二价金属离子及辅助蛋白配比。该发明专利技术可应用于基因编辑效率的检测、DNA样品中错误序列的消除、基因编辑个体的筛查、样本中InDel和SNP位点的检测筛选、将InDel和SNP位点转化为分子标记进行分子辅助育种。

【技术实现步骤摘要】
T7EI-like核酸酶反应缓冲体系、DNA错配检测方法及应用
本专利技术属于生物
，涉及分子生物学、基因工程和生物技术应用，具体涉及一种增强T7EI-like核酸酶错配切割能力的方法及应用。
技术介绍
物种和个体之间的差异由其基因组和基因序列中的差异决定，快速筛选判断同源序列之间是否存在差异及差异的实质是分子生物学研究和生物
重要议题，相关研究方法和技术不仅在医学和农业领域具有广泛的应用前景，同时具有巨大的市场价值。无论是自然进化、人工诱变或者定向编辑产生的同源序列变异，其序列间的差异可分为插入缺失(InDel)和单核苷酸多态性(SNP)两大类。如何检测不同个体间同源序列间是否存在差异？目前主流的方法有三种：其一是PCR+电泳法，首先通过PCR扩增获得目标DNA片段，然后通过高分辨率电泳检测序列长度和序列本身是否存在差异，长片段的InDel型差异相对容易检测，如果InDel的长度过短，需要通过极高分辨率的测序胶才能分辨，SNP型的差异需要通过变性电泳分析单链构象多态性(SSCP)，该技术操作难度则更大。其二是PCR+错配切割法，同样先进行PCR扩增，然后将待检测DNA片段和已知DNA片段进行变性退火，如果两序列间存在差异，则会形成错配，然后加入特异识别错配位点的核酸酶进行切割，该方法通过特异酶的切割，将错配信号进行转化。常用于错配识别的核酸酶包括来自T7噬菌体的T7EI(T7endonucleaseI)和芹菜的CELI核酸酶，前者识别InDel型错配的能力更强，后者识别SNP的能力更好。其三是PCR+测序，通过测序可以最终明确序列之间的差异，但相对成本较前两者要高许多。上述方法各有优缺点，又有各自的应用领域。T7EI是T7噬菌体基因3的编码产物，是一种多功能结构特异性核酸酶(NP_041972.1)，可以识别并切割HolidayDNA、错配DNA和切刻(nick)DNA。错配DNA包括前面提到的InDel型和SNP型。T7EI识别HolidayDNA的活力最强，其次是InDel型错配，其识别SNP型错配的能力较弱。T7EI还有随机切刻(randomnick)活性和切刻位点切割(nick-sitecleavage)活性。P-SSP7EI(P-SSP7endonucleaseI，YP_214193)是由蓝细菌噬菌体P-SSP7基因3编码的T7EI同源蛋白，该蛋白具有T7EI类似的HolidayDNA和错配DNA识别和切割活性，但其nick-site切割活性与T7EI具有很大差异[5]。T7EI自发现以后便应用于突变检测，随着人们对序列变异检测需求的不断增加，基因编辑技术的兴起，其应用更加广泛。目前市面上既有单独销售的T7EI，也有基于该酶开发的各种试剂盒。如NEB公司基于该酶开发的基因编辑检测试剂盒EnGenMutationDetectionKit，Clonetech公司开发的Guide-itInDelIdentificationKit。T7EI是一种多功能核酸酶，虽然目前该酶广泛应用于突变筛查检测，但该酶的一些特征影响了该酶的应用。首先该酶对不同错配底物的识别效率存在明显差异，其对HolidayDNA识别切割效率最高，其次是InDel型错配，其对SNP型错配的识别效果较差，而且对错配碱基的类别具有一定偏好性[3]。在实际应用中InDel和SNP型错配是同时存在的，使得检测结果容易遗漏SNP型差异，即便检测出部分SNP型差异，结果也具有偏向性。其次T7EI除了能特异识别序列中的特异结构并从该位点对DNA进行切割外，还具有非专一性的随机切刻活性和切刻位点切割活性，这意味着即便序列里不存在错配，DNA也会被该活性缓慢降解，这种活性在错配检测反应中应该被抑制或消除。
技术实现思路
T7EI-like核酸酶在错配切割反应中对SNP型错配识别能力低，且具有碱基偏好性；同时该酶具有随机降解任意DNA的能力，该能力会影响错配识别切割效果。为了解决T7EI-like核酸酶在错配DNA检测面临的上述问题，本专利技术提供了一种提高T7EI-like核酸酶识别切割错配DNA的方法和反应缓冲体系，提高和拓展T7EI-like核酸酶在突变检测、筛查、追踪中的应用。为克服T7EI-like核酸酶应用中的上述问题，本专利技术采取如下技术方案：本专利技术公开了一种T7EI-like核酸酶的反应缓冲体系：一种T7EI-like(T7endonucleaseI-like)核酸酶反应缓冲体系，包括T7EI-like核酸酶，提供缓冲能力的Tris-HCl和Tris-Ac，增强酶蛋白分散度的去垢剂TritonX-100和Tween-20，参与底物结合和催化的金属离子Mg2+、Co2+、Mn2+等，包括增强酶稳定性的BSA等非特异蛋白，包括抵消非特异性切割活力的DNAligase等。上述T7EI-like核酸酶包括T7EI(T7endonucleaseI)及P-SSP7EI(P-SSP7endonucleaseI)及其同源蛋白；上述蛋白可以来自商品化产品，可以通过表达纯化获得，可以是酶蛋白本身，也可以是T7EI-like蛋白的融合蛋白，如麦芽糖结合蛋白(MBP)融合的T7EI，应用前需要对其活力进行标定；所述缓冲能力提供者为Tris-HCl或Tris-Ac或其它缓冲剂，缓冲试剂的终浓度为20～50mM，pH在7.4～9.0之间；所述增强酶蛋白分散度的去垢剂包括TritonX-100和Tween-20，TritonX-100的浓度为0.1～0.5％，Tween-20的浓度为0.02～0.1％；所述参与底物结合和催化的金属离子包括Mg2+、Co2+、Mn2+等，其浓度为2～10mM；所述增强酶稳定性的非特异蛋白为BSA等，浓度为10～100ng/ml；所述抵消T7EI-like核酸酶非特异性切割活力的蛋白主要为DNAligase，如T4-ligase，Taq-ligase，Ecoli-ligse等，需要加入各种ligase对应的底物，如ATP或NAD+。应用上述增强的T7EI-like核酸酶错配识别切割反应缓冲体系时，首先需要对检测的DNA样品进行前处理，前处理主要的目标是形成错配DNA，并去除原来缓冲体系中的各种物质。前处理通常涉及变性退火和DNA沉淀两个步骤，第一步用于形成错配DNA，第二步用于去除原来缓冲体系中的各种缓冲试剂、离子和蛋白。随后加入本专利技术公布的缓冲液和T7EI-like核酸酶，在酶的最适反应温度(如37℃)温浴适当时间(如20～30分钟)，然后利用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，根据电泳结果判断原来的DNA样品中是否存在错配。上述方法是一种通用的错配DNA检测方法，可应用于各种领域，如基因编辑效率的检测，基因编辑个体的筛选，特定已知变异筛查，DNA中是否存在变异的发现、Tilling中利用T7EI-like核酸酶和该反应体系替代芹菜CELI核酸酶筛选已知基因的不同变异，分子育种中利用该技术可以将任意的InDel和SNP变异转化为分子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种T7EI-like核酸酶反应缓冲体系，其特征在于，该反应缓冲体系包括T7EI-like核酸酶、缓冲试剂、去垢剂、催化金属离子、稳定剂和DNA连接酶；/n所述缓冲试剂采用Tris-盐酸或Tris-醋酸中的一种；/n所述去垢剂采用Triton X-100和/或Tween-20；/n所述催化金属离子的金属离子包括Mg

【技术特征摘要】
1.一种T7EI-like核酸酶反应缓冲体系，其特征在于，该反应缓冲体系包括T7EI-like核酸酶、缓冲试剂、去垢剂、催化金属离子、稳定剂和DNA连接酶；
所述缓冲试剂采用Tris-盐酸或Tris-醋酸中的一种；
所述去垢剂采用TritonX-100和/或Tween-20；
所述催化金属离子的金属离子包括Mg2+、Co2+或Mn2+中的一种或多种；
所述稳定剂包括BSA。


2.如权利要求1所述T7EI-like核酸酶反应缓冲体系，其特征在于，所述T7EI-like核酸酶，包括来自于大肠杆菌T7噬菌体的T7EI核酸酶，以及与T7EI核酸酶同源且催化特性类同的其它核酸酶；或者包括来自蓝细菌P-SSP7噬菌体的P-SSP7EI核酸酶，以及与P-SSP7EI核酸酶同源且催化特性类同的其它核酸酶。


3.如权利要求1所述T7EI-like核酸酶反应缓冲体系，其特征在于，所述缓冲试剂的终浓度为20～50mM，pH在7.4～9.0之间；
所述去垢剂用于增强酶蛋白分散度，TritonX-100的体积浓度为0.1～0.5％，或Tween-20的体积浓度为0.02～0.1％；
所述金属离子用于参与底物结合和催化，浓度为2～10mM；
所述稳定剂为增强酶稳定性的非特异蛋白，浓度为10～100ng/ml；
所述DNA连接酶用于抵消T7EI-like核酸酶非特异性切割活力，包括T4-ligase、Taq-ligase以及Ecoli-ligse中的一种，还包括底物ATP或NAD+。


4.一种DNA错配检测方法，其特征在于，
首先，对待检测的...

【专利技术属性】
技术研发人员：范三红，单丽伟，胡小平，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61