一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法技术

本发明专利技术的目的在于提供一种快速、简便、经济地检测纯硫氧还蛋白还原酶、细胞和体内组织中硫氧还蛋白还原酶活性的新方法。利用水溶性的硫氧还蛋白还原酶底物(TRS)分子4‑氨基‑1，2‑二硫戊环类化合物，代替经典的硫氧还蛋白联用胰岛素终点法检测硫氧还蛋白还原酶(TrxR)活性，本发明专利技术所述的TRS检测TrxR活性的方法，具有很好的创新性性(首次发展的具有专一选择性的TRS分子；首次将其应用于TrxR活性的检测)、经济环保性(降低原有方法的成本)，在体外纯TrxR、细胞内TrxR和体内组织TrxR活性检测方面具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法
本专利技术涉及化学医药领域，具体而言，涉及一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法。
技术介绍
硫氧还蛋白系统由硫氧还蛋白还原酶(ThioredoxinReductase,TrxR)、硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)和NADPH组成。在生物体内TrxR从NADPH获取电子，使其内源性底物Trx处于还原状态，进而保证下游一系列氧化还原信号通路的正常运行(TrendsPharmacolSci,2017,38:794-808.)。因此，Trx系统在调节生物体内氧化还原信号通路和维持正常的氧化还原水平中扮演非常重要的角色。1977年人类首次从牛的组织中分离纯化出TrxR，并且发现哺乳动物的TrxR可以催化机体的许多生化反应(JBiolChem,1977,252(13):4600-6.)。Stadtman等人于1996年从人的T-细胞及肺癌细胞中分离纯化出TrxR，并探知它是一种含硒的蛋白质(ProcNatlAcadSciUSA,1996,93(3):1006-11.)。从此科学家对硫氧还原蛋白系统的研究也越来越热并取得了一定成果。比如研究发现Trx系统与多种疾病如癌症、糖尿病、神经退行性疾病和老年性高血压等息息相关(TrendsPharmacolSci,2017,38:794-808.)。TrxR和Trx的活性极有可能作为检测这些疾病的生物标志，所以发展检测TrxR活性的工具分子和方法很有临床意义。经典的检测生物体内TrxR活性的方法是Trx联用的胰岛素(Insulin)终点法，该方法主要原理是，在待测样品中，通过额外引用过量的NADPH、Trx和胰岛素，使得TrxR还原Trx这一步成为整个循环反应的决速步骤。TrxR将Trx还原后，Trx进一步特异性将胰岛素还原生成巯基。最后通过巯基检测试剂DTNB滴定反应中生成的巯基量间接反应待测样品中TrxR活性(MethodsEnzymol,1999,300,226-239.)。尽管该方法在研究TrxR生物功能和靶向TrxR的药物研发中得到广泛的应用，但是在该方法中所使用的Trx和胰岛素价格昂贵，在一定程度上限制了这一方法的应用。因此发展一种能快速、简便且经济的检测TrxR活性的方法对TrxR的生物功能探究和靶向硫氧还蛋白系统的药物研发至关重要。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术所述的一种能快速、简便且经济的检测TrxR活性方法的设计思路为：设计一种能够快速且专一的识别TrxR的硫氧还蛋白还原酶底物(ThioredoxinReductaseSubstrate,TRS，图1)分子，利用TrxR结构中暴露于蛋白表面的硒半胱氨酸(Sec)将TRS中二硫键还原成巯基，最后利用5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)滴定巯基，以反映体系中的TrxR活性。为解决上述问题，本专利技术所述的一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法，具体步骤如下：(1)基于以上设计思路，设计能够识别TrxR的TRS类分子。(2)TRS类分子对TrxR响应考察，以选择理想的TRS。(3)TRS类分子对TrxR专一性考察，以选择理想的TRS。(4)所选的TRS分子检测TrxR活性的方法建立。(5)TRS分子检测TrxR活性方法的应用。本专利技术方法与现有技术比较：现有技术方法(图2A)：经典的检测生物体内TrxR活性的方法是Trx联用的胰岛素(Insulin)终点法，该方法主要原理是，在待测样品中，通过额外引用过量的NADPH、Trx和胰岛素，使得TrxR还原Trx这一步成为整个循环反应的决速步骤。TrxR将Trx还原后，Trx进一步特异性将Insulin还原生成巯基。最后通过巯基检测试剂DTNB滴定反应中生成的巯基量间接反应待测样品中TrxR活性。该方法中所使用的Trx和胰岛素价格昂贵，在一定程度上限制了这一方法的应用。本专利技术方法(图2B)：我们利用水溶性的TRS分子4-氨基-1，2-二硫戊环类化合物，代替经典的Trx联用胰岛素终点法检测TrxR活性，该方法中不涉及Trx和Insulin，在很大程度上降低了检测成本。本专利技术所述的TRS检测TrxR活性的方法，具有很好的创新性性(首次发展的具有专一选择性的TRS分子；首次将其应用于TrxR活性的检测)、经济环保性(降低原有方法的成本)，在体外纯TrxR、细胞内TrxR和体内组织TrxR活性检测方面具有很好的应用前景。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明。但不应将此理解为对本专利技术方法的限制。图1为TRS结构通式，R可以代表-CH3，-NH2，-COOH，-OH，CH2OH等给电子或者吸电子基团，我们所选取的检测TrxR活性的分子对TrxR具有很好的选择性。图2现有检测TrxR方法(图2A)和本专利技术检测TrxR方法(图2B)的原理图。图3为TRS对TrxR选择性的考察，本专利技术所呈现的TRS能很好地结合TrxR结构中498位的硒半胱氨酸(Sec)残基(图3A)，当TrxR结构中498位的硒半胱氨酸残基被突为半胱氨酸(U498CTrxR)后，结合能力丢失(图3A)；与谷胱甘肽(GSH)结合也很差(图3B)，本专利技术所呈现的方法对TrxR具有很好地选择性。图4本专利技术所呈现的方法对已知的TrxR抑制剂金诺芬(AF)抑制细胞内TrxR的活性检测具有很好的浓度依赖关系，说明该方法能很好地应用于TrxR活性的检测(图4A)；该方法对敲低TrxR表达的HeLa细胞中的TrxR活性也具有很好检测，说明该方法能很好地应用于TrxR活性的检测(图4B)。具体实施方式实施例1：一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法，包括以下步骤：(1)设计并合成能够识别TrxR的TRS类分子。二硫化合物是一类具有多种生物功能的氧化还原活性化合物。研究证明许多二硫化合物都是TrxR很好的底物。基于此本专利技术设计合成了一系列环状二硫化合物。实例1的操作方法：化合物1：在250mL圆底烧瓶中加入37％的甲醛溶液(81mL)和K2CO3(1g,7.2mmol)，然后逐滴加入丙二酸二乙酯(80g,0.5mol)，40至50分钟内加完。室温搅拌1h后加入160mL饱和硫酸铵溶液，用乙醚萃取，分离有机相，有机相用无水硫酸镁干燥1h，过滤，减压旋干有机溶剂后即得化合物1，无需进一步纯化，直接投入下一步反应。化合物2：将化合物1-1(50g,0.23mol)和48％的氢溴酸(104mL,0.91mol)置于250mL圆底烧瓶中，于120℃加热回流14h。原料全部反应后，减压除去过量的氢溴酸，得到淡黄色固体。将此固体溶于50mL二氯甲烷中，水洗几遍，分离有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干即得化合物2，为白色固体(35.2g，产率94％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.97(br,1H),6.18(s,1H),6.06(s,1H),4.2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法，其特征在于快速、简便、经济地检测纯酶、细胞和体内组织中硫氧还蛋白还原酶的活性。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法，其特征在于快速、简便、经济地检测纯酶、细胞和体内组织中硫氧还蛋白还原酶的活性。


2.根据权利要求1所述，一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法，包括以下步骤：
(1)基于以上设计思路，设计能够识别硫氧还蛋白还原酶(TrxR)的TRS类分子。
(2)TRS类分子对TrxR响应考察，以选择理想的TRS。
(3)TRS类分子对TrxR专一性考察，以选择理想的TRS。
(4)所选的TRS分子检测TrxR活性的方法建立。
(5)TRS分子检测TrxR活性方法的应用。


3.根据权利要求1和2所述一种检测硫氧还蛋白还原酶活性的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的能够识别TrxR的TRS类分子。


4.根据权利要求1和2所述一种检...

【专利技术属性】
技术研发人员：房建国，张军民，李新明，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62