一种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建与生产方法技术

本发明专利技术公开的属于临床化学药剂合成技术领域，具体为一种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs‑5‑YHEDA肽载体构建与生产方法，一种5’端为Ecor I限制性内切酶序列和3’端为Hind III限制性内切酶序列的含bs‑5‑YHEDA基因的DNA；该种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs‑5‑YHEDA肽载体构建与生产方法，通过缩合法开发制备了一种可跨越血脑屏障的bs‑5‑YHEDA肽，可进入AD脑组织降铁除自由基，将bs‑5‑YHEDA翻译成对应的DNA序列构建了人工基因，重组到分泌表达型载体pIN III ompA3，转化到大肠杆菌表达菌产bs‑5‑YHEDA肽，并借助载体表达的ompA导肽分泌到菌体外周，用盐析沉淀，透析和HPLC提纯，合成足够长度的多肽，节约生产成本，可实现量产，用于临床。

【技术实现步骤摘要】
一种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建与生产方法
本专利技术涉及临床化学药剂合成
，具体为一种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建与生产方法。
技术介绍
老年痴呆症又称为阿尔茨海默病，是老年人中常见的一种神经退行性疾病，临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明，发病时给病人和其家庭带来极大困扰。对于老年痴呆症目前尚无有效疗法，研究发现随着年龄增长，脑内铁会逐渐积累含量变高，铁可催生自由基损害脑组织，是诱发AD的重要原因。目前，在肽树脂上重复进行“Fmoc去保护——氨基酸缩合”反应方法，按照设计好氨基酸序列，从零开始，将第一个氨基酸连到树脂上，然后按顺序一个一个把后续的氨基酸缩合到已有的序列上去，每加一个氨基酸，进行一次缩合反应，直到所有的序列都缩合到前面已有的肽序列，就完成蛋白质的合成，合成了的可溶性的可跨越血脑屏障进入脑内螯合铁的多肽bs-5-YHEDA，以证明它可在脑内储铁，降自由基，保护脑组织神经元。但是，这种制备方法周期长，成本高，可合成的序列短，一般少于100个氨基酸长度，难以满足需求，可合成序列短，无法获得需要长度和分子量的氨基酸，必然导致病人难以支付昂贵的药费，在用于临床过程中难以实现量产，无法为产业化打下基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建与生产方法，以解决上述
技术介绍
中提出的现有的制备方法周期长，成本高，可合成的序列短，一般少于100个氨基酸长度，难以满足需求，可合成序列短，无法获得需要长度和分子量的氨基酸，必然导致病人难以支付昂贵的药费，在用于临床过程中难以实现量产，无法为产业化打下基础的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建，一种5’端为EcorI限制性内切酶序列和3’端为HindIII限制性内切酶序列的含bs-5-YHEDA基因的DNA，经限制性内切酶EcorI和HindIII酶切后，插入到经限制性内切酶EcorI和HindIII酶切的pINIIIompA3载体的多克隆片段切口之间，和pINIIIompA3载体的编码导肽的ompADNA之后，形成pINIIIompA3-bs-5-YHEDA载体；将pINIIIompA3-bs-5-YHEDA载体转化到JM101感受态大肠杆菌，在诱导表达后，pINIIIompA3载体中的启动子可启动bs-5-YHEDA基因转录翻译，ompADNA转录翻译成的导肽可将bs-5-YHEDA分泌到菌体外周质，导肽被自动切除。一种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建的生产方法，该种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建的生产方法包括以下步骤：S1：bs-5-HAYED人工基因构建：根据基因密码，编码bs-5-YHEDA肽的DNA序列为:5’-catgcctaccaggatcatgcctaccaggatcatgcctaccaggatcatgcctaccaggatcatgcctaccaggatcagtcagacatcgtcgcacaatcctcctaa-3’；分别在两端加上EcoRI限制性酶识别序列“G^AATTC”，和HINDIII限制性酶识别序列“A^AGCTT”便于剪接插入，3'末端加上终止密码子taa；S2：分泌表达型载体pINIIIompA3-bs-5-YHEDA构建：委托公司合成以上DNA序列，用EcoRI和HindIII限制性内切酶将bs-5-HAYED人工基因切下来，提取存储在DH5α大肠杆菌中的分泌型表达载体pINIIIompA3质粒，用上述限制性内切酶将pINIIIompA3质粒的多克隆位点切开，并将切下的bs-5-HAYED人工基因用T4DNA连接酶连到pINIIIompA3切口内，最后成为pINIIIompA3-bs-5-YHEDA载体；S3：转化与阳性菌落筛选：用CaCl2法制备JM101感受态细胞，将pINIIIompA3-bs-5-YHEDA载体质粒转化入JM101感受态细胞后，涂布到加有氨苄青霉素培养基的平皿，筛选AmpR的白色菌落，并用PCR和电泳鉴定；S4：挑菌落扩增和诱导表达：挑单菌落，置10毫升中试管37℃摇床培养12小时后，将菌液移到250毫升三角瓶37℃振摇培养过夜，加入终浓度为0.01mM的IPTG，23℃震荡培养诱导表达4～6小时；S5：细菌膜周质蛋白提取：离心收集菌体，重悬浮于含10mMpH7.5Tris的20％蔗糖溶液中，0℃放置5分钟，再加入0.5MPH8.0的EDTA，0℃静置10分钟，离心去上清，沉淀经蒸馏水洗涤后，悬浮在1MPH7.6的Tris溶液中，0℃下放置30分钟，离心取上清加入1/10体积的100％三氯醋酸，0℃静置15分钟，离心弃上清，沉淀用70％冷乙醇洗涤两次，冷冻干燥备用，该沉淀含有可溶性大肠杆菌细胞周质蛋白；S6：HPLC提纯，MASS-测序鉴定收集的bs-5-YHEDA峰：用25％饱和度硫酸铵盐析除杂蛋白沉淀，将盐析后的蛋白液透析后经LysineSepharose亲和层析，将各峰收集上HPLCMonoQI阴高子交換柱，在pH8.5下进行梯度洗脱，除少量杂蛋白外，收集各峰用抗bs-5-HAYED抗体鉴别阳性反应的组分，并用质谱和蛋白测序仪鉴定。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：该种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建与生产方法，通过缩合法开发制备了一种可跨越血脑屏障的bs-5-YHEDA肽，可进入AD脑组织降铁除自由基，将bs-5-YHEDA翻译成对应的DNA序列构建了人工基因，重组到分泌表达型载体pINIIIompA3，转化到大肠杆菌表达菌产bs-5-YHEDA肽，并借助载体表达的ompA导肽分泌到菌体外周，用盐析沉淀，透析和HPLC提纯，合成足够长度的多肽，节约生产成本，可实现量产，用于临床，并为产业化打下基础。附图说明图1为本专利技术bs-5-YHEDA基因结构图示意图；图2为本专利技术分泌表达型载体pINIIIompA3-bs-5-YHEDA构建示意图；图3为本专利技术酶连鉴定示意图；图4为本专利技术JM101提取质粒酶切鉴定示意图；图5为本专利技术PCR扩增bs-5-YHEDA基因结果示意图；图6为本专利技术质粒bs-5-YHEDA基因PCR测序结果示意图；图7为本专利技术HPLC提纯示意图；图8为本专利技术WesternBlot鉴定HPLC提纯的周质蛋白中表达的bs-5-YHEDA示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建，其特征在于：一种5’端为Ecor I限制性内切酶序列和3’端为Hind III限制性内切酶序列的含bs-5-YHEDA基因的DNA，经限制性内切酶Ecor I和Hind III酶切后，插入到经限制性内切酶EcorI和HindIII酶切的pIN III ompA3载体的多克隆片段切口之间，和pIN III ompA3载体的编码导肽的ompA DNA之后，形成pIN III ompA3-bs-5-YHEDA载体；/n将pIN III ompA3-bs-5-YHEDA载体转化到JM101感受态大肠杆菌，在诱导表达后，pINIII ompA3载体中的启动子可启动bs-5-YHEDA基因转录翻译，ompA DNA转录翻译成的导肽可将bs-5-YHEDA分泌到菌体外周质，导肽被自动切除。/n

【技术特征摘要】
1.一种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建，其特征在于：一种5’端为EcorI限制性内切酶序列和3’端为HindIII限制性内切酶序列的含bs-5-YHEDA基因的DNA，经限制性内切酶EcorI和HindIII酶切后，插入到经限制性内切酶EcorI和HindIII酶切的pINIIIompA3载体的多克隆片段切口之间，和pINIIIompA3载体的编码导肽的ompADNA之后，形成pINIIIompA3-bs-5-YHEDA载体；
将pINIIIompA3-bs-5-YHEDA载体转化到JM101感受态大肠杆菌，在诱导表达后，pINIIIompA3载体中的启动子可启动bs-5-YHEDA基因转录翻译，ompADNA转录翻译成的导肽可将bs-5-YHEDA分泌到菌体外周质，导肽被自动切除。


2.根据权利要求1所述的一种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建的生产方法，其特征在于：该种可产降铁除自由基治疗阿兹海默病的bs-5-YHEDA肽载体构建的生产方法包括以下步骤：
S1：bs-5-HAYED人工基因构建：根据基因密码，编码bs-5-YHEDA肽的DNA序列为:5’-catgcctaccaggatcatgcctaccaggatcatgcctaccaggatcatgcctaccaggatcatgcctaccaggatcagtcagacatcgtcgcacaatcctcctaa-3’；
分别在两端加上EcoRI限制性酶识别序列“G^AATTC”，和HINDIII限制性酶识别序列“A^AGCTT”便于剪接插入，3'末端加上终止密码子taa；
S2：分泌表达型载体pINIIIompA3-bs-5-YHEDA构建：委托公司合成以上DNA序列，用EcoR...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹珍友，
申请(专利权)人：桂林医学院，
类型：发明
国别省市：广西;45