栽培花生AhGPAT9B基因的克隆方法技术

本发明专利技术公开了一种栽培花生AhGPAT9B基因的克隆方法。本发明专利技术设计筛选了7对覆盖AhGPAT9基因的引物(BG01‑BG07)，能够特异扩增栽培花生B染色体组AhGPAT9B基因，为深入研究花生GPAT9基因、解析种质间AhGPAT9B基因的等位变异提供技术支持，对于深入分析基因功能和同源基因间的关系有重要参考意义，同时对利用基因工程提高花生含油量和培育高油花生新品种具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
栽培花生AhGPAT9B基因的克隆方法
本专利技术涉及植物基因工程
，具体涉及一种栽培花生AhGPAT9B基因的克隆方法。
技术介绍
花生是我国三大油料作物之一，是植物油脂和蛋白质的主要来源。三酰甘油(TAG)是植物油脂的主要形式，在植物TAG的生物合成途径中，三酰甘油酰基转移酶(GPAT)将酰基载体蛋白或酰基辅酶A上的脂酰基转移到甘油-3-磷酸(G3P)的sn-1位置，形成溶血磷脂酸(LPA)，是催化TAG合成的第一个酰基转移酶，对种子的发育以及油脂的积累具有重要作用。植物GPAT家族含有很多成员。GPAT9是目前鉴定的唯一直接参与真核途径膜脂和油脂合成的GPAT家族成员，定位于内质网，属于膜结合蛋白，与动物脂肪合成相关的mGPAT3和mGPAT4同源性最高。研究花生GPAT9基因为深入系统地解析花生油脂合成通路和花生高油育种提供理论基础，对利用基因工程提高花生含油量和培育高油花生新品种具有重要意义。栽培花生(ArachishypogaeaL.)是异源四倍体(2n＝4x＝40，AABB)，是由两个花生区组的二倍体祖先野生种A.duranensis(AA)和A.ipaensis(BB)天然杂交后经过一次性自然加倍事件形成的，基因组大小为2.7Gb。由于栽培花生包括A和B两个染色体组，且有些A染色体组和B染色体组间的同源基因序列相似性极高，因此分别克隆A染色体组和B染色体组基因序列难度较大。在以往的研究中，克隆获得的花生基因大多数未进行A和B染色体组的区分，例如，有研究者从栽培品种花育19获得了1个AhGPAT9基因，该基因在茎、花和种子中均有表达，但分属于哪个染色体组并不清楚。研究表明花生A染色体组和B染色体组间的同源基因在功能上可能存在冗余、累加、互补等多种复杂关系，因此，对两个染色体组的基因开展特异克隆和分析，对于深入分析基因功能和同源基因间的关系有重要参考价值。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种栽培花生AhGPAT9B基因的克隆方法。本专利技术通过分段设计引物组合，从栽培花生品种丰花2号中特异的分离得到B染色体组AhGPAT9B基因，对于深入分析研究AhGPAT9B基因的功能以及与同源基因AhGPAT9A之间的作用关系具有重要的意义。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种用于克隆栽培花生AhGPAT9B基因的引物组合，所述引物组合包括：引物对BG01，其序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；引物对BG02，其序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；引物对BG03，其序列分别如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；引物对BG04，其序列分别如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示；引物对BG05，其序列分别如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示；引物对BG06，其序列分别如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示；和，引物对BG07，其序列分别如SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示。本专利技术的第二方面，提供上述引物组合在从栽培花生中克隆获得B染色体组AhGPAT9B基因中的应用。本专利技术的第三方面，提供一种栽培花生AhGPAT9B基因的克隆方法，包括以下步骤：(1)以从花生叶片中提取的基因组DNA为模板，利用上述引物组合分别进行PCR扩增，得到7段PCR扩增产物；(2)将步骤(1)得到的7段PCR扩增产物分别与克隆载体连接，筛选阳性克隆，将阳性克隆进行扩大培养，并进行测序；(3)将测序正确的7个片段进行拼接，得到完整的包含5’和3’末端的AhGPAT9B全长DNA序列。优选的，步骤(1)中，PCR扩增的体系为20μL，包括：模板DNA2μL，10μM的上/下游引物各0.5μL，10×PCRbufferⅡ(含Mg2+)2μL，2.5mMdNTPs1.6μL，TransStartTaq0.2μL，ddH2O13.2μL。优选的，步骤(1)中，PCR扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，(50-59℃)退火45s，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃后延伸10min。优选的，步骤(2)中，PCR扩增产物与克隆载体连接的方法为：将4μLPCR扩增产物和1μL克隆载体混合，25℃反应20min。优选的，步骤(3)中，所述拼接具体为：将测序正确DNA片段在DNAMAN软件中依次进行比对分析，利用相邻扩增片段间的重叠部分进行序列拼接，获得完整AhGPAT9B基因全长序列。本专利技术的有益效果：本专利技术设计筛选了7对覆盖AhGPAT9基因的引物(BG01-BG07)，能够特异扩增栽培花生B染色体组AhGPAT9B基因，为深入研究花生GPAT9基因、解析种质间AhGPAT9B基因的等位变异提供技术支持，对于深入分析基因功能和同源基因间的关系有重要参考意义，同时对利用基因工程提高花生含油量和培育高油花生新品种具有重要意义。附图说明图1：利用长片段扩增酶(TransStartFAstPfuFlyDNAPolmerase)对AhGPAT9B基因进行全序列扩增电泳结果；其中，A：采用的引物对1进行扩增，泳道1-5分别表示引物退火温度51℃、53℃、55℃、57℃、59℃，M为DL5000marker；B：采用的引物对2进行扩增，泳道1-5分别表示引物退火温度51℃、53℃、55℃、57℃、59℃，M为DL5000marker。图2：分段克隆AhGPAT9B基因序列扩增电泳结果；其中，A-G分别表示筛选出的BG01-BG07引物对扩增结果，其中M为DL2000marker，1-6泳道分别为花生种质丰花2号、A596、皱叶、昌花1号、QD花生和花育17的DNA扩增结果；H和I为引物筛选过程中出现的非特异性扩增现象。M为DL2000marker，1-12泳道分别为引物退火温度49-60℃时的扩增结果。其中H采用的引物对为f14(5’-ACCTCAAGAGACATACACAAAGC-3’)和r14(5’-GATAAAATCACAGAAGGGAAC-3’)，I采用的引物对为f16(5’-TTGGAGCCACAGAATCAGAAG-3’和r16(5’-CCCGAAGGAAAAAAGAAGAC-3’)。图3：荧光定量PCR扩增反应的溶解曲线图。特异性扩增显示AhGPAT9B基因在81℃有明显单一产物峰，无杂峰出现，证明了引物的特异性。非特异性扩增显示在81℃和78℃均有产物峰，出现了非特异性扩增。图4：7对引物扩增AhGPAT9B基因片段的分布图示；数字表示扩增的起始和结束位置。图5：AhGPAT9B基因结构特征示意图。图6：花生AhGPAT9B与拟南芥和大豆GPAT9蛋白序列比对图。AtGPAT9蛋白序列的NCBI注册号NP_568925，大豆GmGPAT9蛋白序列的NCBI注册号XP_003524805。...

【技术保护点】
1.一种用于克隆栽培花生AhGPAT9B基因的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括：/n引物对BG01，其序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；/n引物对BG02，其序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；/n引物对BG03，其序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；/n引物对BG04，其序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；/n引物对BG05，其序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；/n引物对BG06，其序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；和，/n引物对BG07，其序列分别如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于克隆栽培花生AhGPAT9B基因的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括：
引物对BG01，其序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；
引物对BG02，其序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；
引物对BG03，其序列分别如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；
引物对BG04，其序列分别如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示；
引物对BG05，其序列分别如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示；
引物对BG06，其序列分别如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示；和，
引物对BG07，其序列分别如SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示。


2.权利要求1所述的引物组合在从栽培花生中克隆获得B染色体组AhGPAT9B基因中的应用。


3.一种栽培花生AhGPAT9B基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以从花生叶片中提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物组合进行PCR扩增，得到7段PCR扩增产物；
(2)将步骤(1)得到的7段PCR扩增产物分别与克隆载体连接，筛选阳性克隆，将阳性克隆...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘风珍，万勇善，张秀荣，吕玉英，骆璐，张昆，朱素青，杨会，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37