CTNNB1基因在猪卵巢颗粒细胞中的应用制造技术

本发明专利技术公开CTNNB1基因在猪卵巢颗粒细胞中的应用，属于细胞工程和基因工程技术领域。本发明专利技术检测了猪不同时期卵巢组织、不同大小卵泡及其颗粒细胞中CTNNB1mRNA的相对表达量，以及超表达和抑制CTNNB1后颗粒细胞的增殖、凋亡及类固醇激素的分泌情况。结果显示，CTNNB1基因参与促进颗粒细胞的增殖和雌二醇的分泌，抑制颗粒细胞的凋亡和睾酮、孕酮的分泌，说明CTNNB1基因参与母猪卵巢卵泡的发育和成熟。本发明专利技术为母猪卵巢卵泡发育过程中的分子机制研究积累了材料。

【技术实现步骤摘要】
CTNNB1基因在猪卵巢颗粒细胞中的应用
本专利技术属于细胞工程和基因工程
，具体涉及CTNNB1基因在猪卵巢颗粒细胞中的应用。
技术介绍
卵巢作为哺乳动物的关键繁殖器官，其主要功能是产生并排出卵子。哺乳动物初情期后，下丘脑-垂体-性腺轴的生长分泌机能逐渐完善，其分泌至血液中的促性腺激素水平升高，并作用于卵巢，促进卵巢发挥排卵和分泌生殖激素的功能。卵泡是卵巢的功能单位，由卵母细胞、颗粒细胞和膜细胞构成，其生长发育以及选择性排卵过程都受到了内分泌、旁分泌以及自分泌因子等的调控。不同发育阶段的卵泡均存在于卵巢皮质结构中，卵泡以卵泡波的形式被募集，并在生殖激素的刺激下逐步发育成熟，形成一个周期性排卵过程。根据卵泡发育的形态结构变化，可将卵泡大致分为原始卵泡、生长卵泡和成熟卵泡三个生长阶段。卵泡发育最为显著的形态变化特征为颗粒细胞的增殖。原始卵泡时期，卵母细胞被单层扁平状的颗粒细胞所包裹，随着卵泡的发育，颗粒细胞逐渐增殖至数层，且形态也由扁平状变为柱状，并在卵泡成熟排卵前形成包裹卵母细胞的卵丘颗粒细胞和紧贴卵泡内壁的壁层颗粒细胞。颗粒细胞通过促性腺激素受体、类固醇激素、各类生长因子及细胞因子等调控卵泡的发育和闭锁。目前关于CTNNB1基因对猪卵巢颗粒细胞功能的影响尚未见报道。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供CTNNB1基因在猪卵巢颗粒细胞中的应用。通过基因工程技术改变CTNNB1基因在猪颗粒细胞中的表达量，确定其在猪卵巢颗粒细胞增殖、凋亡及类固醇激素分泌中的应用。本专利技术的另一目的在于提供CTNNB1基因在制备调节猪卵巢颗粒细胞增殖、凋亡和类固醇激素分泌的药物中的应用。本专利技术的再一目的在于提供CTNNB1基因作为猪生长发育标志物的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：CTNNB1基因在猪卵巢颗粒细胞中的应用。体外环境下，CTNNB1基因促进猪卵巢颗粒细胞的增殖，抑制猪卵巢颗粒细胞的凋亡。体外环境下，CTNNB1基因促进猪卵巢颗粒细胞雌二醇的分泌，抑制猪卵巢颗粒细胞睾酮和孕酮的分泌。CTNNB1基因在制备调节猪卵巢颗粒细胞增殖、凋亡和类固醇激素分泌的药物中的应用。所述的调节猪卵巢颗粒细胞增殖、凋亡和类固醇激素分泌的方式为：增加CTNNB1基因的表达，促进卵巢颗粒细胞的增殖和雌二醇分泌、抑制卵巢颗粒细胞的凋亡和睾酮和孕酮分泌；抑制CTNNB1基因的表达，抑制卵巢颗粒细胞的增殖和雌二醇分泌、促进卵巢颗粒细胞的凋亡和睾酮和孕酮分泌。所述的增加CTNNB1基因的表达优选通过如下方法实现：构建含有CTNNB1基因的超表达载体，将超表达载体转染猪卵巢颗粒细胞。所述的抑制CTNNB1基因的表达优选通过如下方法实现：将抑制CTNNB1基因表达的siRNA转染猪卵巢颗粒细胞。CTNNB1基因作为猪卵巢卵泡的生长发育标志物的应用。体外环境下，卵泡期卵巢组织中所述的CTNNB1基因的mRNA相对表达量极显著高于(P<0.01)排卵期卵巢组织，排卵期卵巢组织中所述的CTNNB1基因的mRNA相对表达量极显著高于(P<0.01)黄体期卵巢组织。体外环境下，在不同大小卵泡组织中，所述的CTNNB1基因的mRNA相对表达量随卵泡的发育逐渐上调，且中卵泡(3mm-6mm)和大卵泡(>6mm)CTNNB1基因的mRNA相对表达量显著高于小卵泡(<3mm)。体外环境下，在不同大小卵巢颗粒细胞中，所述的CTNNB1基因的mRNA相对表达量随卵泡的发育逐渐上调，且中卵泡(3mm-6mm)和大卵泡(>6mm)中颗粒细胞CTNNB1基因的mRNA相对表达量显著高于小卵泡(<3mm)的颗粒细胞。一种抑制CTNNB1基因表达的siRNA(si-CTNNB1)，其核苷酸序列如下：5′-ATACCATTCCATTGTTTGT-3′(SEQIDNO.1)。所述的抑制CTNNB1基因表达的siRNA的应用环境为体外环境。本专利技术的验证结果如下：1、本专利技术通过qRT-PCR方法检测到母猪卵泡期卵巢组织中CTNNB1mRNA相对表达量极显著高于(P<0.01)排卵期卵巢组织，排卵期卵巢组织中CTNNB1mRNA相对表达量又极显著高于(P<0.01)黄体期卵巢组织。结果说明CTNNB1可能参与猪卵巢卵泡的发育成熟。2、本专利技术通过qRT-PCR方法检测到卵泡CTNNB1基因的mRNA相对表达量随卵泡的发育逐渐上调，且中卵泡(3mm-6mm)和大卵泡(>6mm)中CTNNB1基因mRNA相对表达量显著高于(P<0.05)小卵泡(<3mm)(图2)。结果说明CTNNB1可能参与促进猪卵泡的生长发育。3、本专利技术通过qRT-PCR方法检测到猪卵巢颗粒细胞中CTNNB1基因的mRNA相对表达量随卵泡的发育逐渐上调，且中卵泡(3mm-6mm)和大卵泡(>6mm)中颗粒细胞CTNNB1基因的mRNA相对表达量显著高于(p<0.05)小卵泡(<3mm)颗粒细胞。结果说明CTNNB1的表达可能参与调控猪卵泡发育过程中颗粒细胞的功能。3、本专利技术通过EdU法检测猪卵巢颗粒细胞的增殖情况，发现超表达CTNNB1基因后，与对照组(pcDNA3.1)相比，颗粒细胞的增殖率极显著升高(P<0.01)。抑制CTNNB1基因表达后，与对照组(NC)相比，颗粒细胞的增殖率极显著降低(P<0.01)。4、本专利技术通过AnnexinV-FITC/PI技术检测猪卵巢颗粒细胞的凋亡情况，发现超表达CTNNB1基因后，与对照组(pcDNA3.1)相比，颗粒细胞的凋亡率显著降低(P<0.05)。抑制CTNNB1基因表达后，与对照组(NC)相比，颗粒细胞的凋亡率显著升高(P<0.05)。5、本专利技术通过ELISA技术检测猪卵巢颗粒细胞类固醇激素分泌情况，发现超表达CTNNB1基因后，与对照组(pcDNA3.1)相比，细胞上清中雌二醇浓度显著增加(p<0.05)，睾酮浓度极显著减少(p<0.01)，孕酮浓度显著减少(p<0.05)。抑制CTNNB1基因表达后，与对照组NC相比，细胞上清中雌二醇浓度极显著减少(p<0.01)，睾酮浓度极显著增加(p<0.01)，孕酮浓度极显著增加(p<0.01)。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：本专利技术检测了母猪不同时期卵巢组织、不同大小卵泡及其颗粒细胞中CTNNB1mRNA的相对表达量，并检测了超表达和抑制CTNNB1后颗粒细胞的增殖、凋亡、类固醇激素分泌情况。本专利技术的结果显示CTNNB1基因参与促进颗粒细胞的增殖和雌二醇的分泌，抑制颗粒细胞的凋亡和睾酮、孕酮分泌，说明CTNNB1基因参与母猪卵巢卵泡的生长发育和成熟。本专利技术为CTNNB1调控猪卵巢颗粒细胞的分子机制研究积累了材料。附图说明图1是不同时期猪卵巢组织中CTNNB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.CTNNB1基因在猪卵巢颗粒细胞中的应用，其特征在于：/n体外环境下，CTNNB1基因促进猪卵巢颗粒细胞的增殖，抑制猪卵巢颗粒细胞的凋亡；/n体外环境下，CTNNB1基因促进猪卵巢颗粒细胞雌二醇的分泌，抑制猪卵巢颗粒细胞睾酮和孕酮的分泌。/n

【技术特征摘要】
1.CTNNB1基因在猪卵巢颗粒细胞中的应用，其特征在于：
体外环境下，CTNNB1基因促进猪卵巢颗粒细胞的增殖，抑制猪卵巢颗粒细胞的凋亡；
体外环境下，CTNNB1基因促进猪卵巢颗粒细胞雌二醇的分泌，抑制猪卵巢颗粒细胞睾酮和孕酮的分泌。


2.CTNNB1基因在制备调节猪卵巢颗粒细胞增殖、凋亡和类固醇激素分泌的药物中的应用。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的调节猪卵巢颗粒细胞增殖、凋亡和类固醇激素分泌的方式为：
增加CTNNB1基因的表达，促进猪卵巢颗粒细胞的增殖和雌二醇分泌、抑制猪卵巢颗粒细胞的凋亡和睾酮和孕酮分泌；
抑制CTNNB1基因的表达，抑制猪卵巢颗粒细胞的增殖和雌二醇分泌、促进猪卵巢颗粒细胞的凋亡和睾酮和孕酮分泌。


4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的增加CTNNB1基因的表达通过如下方法实现：构建含有CTNNB1基因的超表达载体，将超表达载体转染猪卵巢颗粒细胞。


5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的抑制CTNNB1基因的表达通过如下方法实现：将抑制CTNNB1基因表达的siRNA转染猪卵巢颗粒细胞。

【专利技术属性】
技术研发人员：张哲，李加琪，李丽莹，袁晓龙，张豪，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44