免疫抑制功能降低的口蹄疫重组病毒及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于兽药生物制品技术领域，具体涉及一种免疫抑制功能降低的口蹄疫重组病毒、重组疫苗株及其制备方法和应用。本发明专利技术首先发现了FMDV 3B蛋白具有免疫抑制功能，并发现了发挥免疫抑制功能的关键位点；其次通过在FMDV 3B蛋白的三个重复拷贝中分别引入关键位点氨基酸突变，构建了FMDV 3B蛋白免疫抑制功能丧失的口蹄疫重组疫苗株，所述口蹄疫重组疫苗株在干扰素通路缺陷的口蹄疫生产细胞系BHK‑21中稳定传代，且不影响病毒滴度，而其在猪源宿主细胞(PK‑15)中毒力下降，发挥了更强的天然免疫应答诱导能力；最后，将获得的重组疫苗株制备成灭活疫苗，能够促进早期免疫应答，诱导高水平抗体产生，提高了生物安全性及免疫保护效力，具备良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
免疫抑制功能降低的口蹄疫重组病毒及其制备方法与应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种免疫抑制功能降低的口蹄疫重组病毒、重组疫苗株及其制备方法和应用。
技术介绍
口蹄疫(Foot-and-mouthdisease，FMD)是一种急性、热性、高度接触性传染病，主要侵害家畜和野生偶蹄类动物。一般成年家畜感染后会自愈，其在自然宿主中存在较高的发病率，在不同种间都表现出典型的病变。幼畜感染或者在野生动物中发生大流行的情况下，FMD可以引发较高的死亡率。FMD被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病，我国也将其列为一类动物疫病。FMD是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV)引起的一种急性发热性疾病，伴随着蹄，口，乳房周围出现水疱，水疱破裂后形成溃疡。动物发病时会出现跛行、精神抑郁、厌食、过度流涎等，且多数病例会出现蹄冠和蹄匣脱落。FMDV也会引起生殖系统的损坏，其中典型的例子就是绵羊和山羊。大多数成年动物在感染2-3周内康复，继发感染康复时间稍长。动物感染康复后可能出现的并发症，包括暂时或永久牛奶产量降低、蹄部畸形、跛行、慢性乳腺炎、体重减轻等。我国近年一直采取强制疫苗免疫为主的防控政策，起到了较好的预防控制效果，但仍难以有效根除FMD，其主要原因就是FMDV能够逃逸宿主免疫系统，而长期存在。更为重要的是，FMDV通过病毒蛋白靶向天然免疫通路分子，抑制天然免疫通路活化，抑制干扰素的产生，进而发挥拮抗作用。病毒自身的免疫抑制性拮抗宿主免疫应答，有利于免疫逃逸变异毒株的存活，造成持续性感染，使口蹄疫的防控变得更加复杂化。为彻底根除口蹄疫，急需提升疫苗的免疫效力，消除其免疫抑制能力，能够降低或阻断持续性感染的新型疫苗。而要想解决此问题，必须从FMDV感染与免疫调控机理研究入手，鉴定参与免疫抑制的相关病毒蛋白及其分子机制，从而为今后发展新的抗病毒策略以及研制新型疫苗提供帮助。FMDV基因组由5'非编码区、开放阅读框(ORF)和3'非编码区组成。ORF编码一个多聚蛋白，之后逐级裂解产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白，ORF依次为L蛋白编码区，P1区、P2区和P3区，L蛋白编码区有两个起始密码子，之间相隔84个碱基，编码Lab和Lb和两种非结构蛋白，P1区编码VP4、VP2、VP3、VP1四种结构蛋白，参与组装病毒衣壳，P2区编码2A、2B、2C三种非结构蛋白，P3区编码3A、3B、3Cpro、3Dpro四种非结构蛋白，其中3B蛋白是FMDV的一个重要毒力因子，其与FMDV的5’非编码区N端结合作为引物，启动病毒3D蛋白(RNA聚合酶)对病毒RNA的合成。3B蛋白具有3个高度同源的拷贝组成，分别命名为3B1、3B2和3B3，这也是FMDV与同科其他病毒不同的地方。并且不同血清型口蹄疫病毒3B1、3B2和3B3的氨基酸序列具有高度同源性，具体序列对比结果如图1所示。同时，3B蛋白能够调节FMDV3A蛋白的功能，进而影响病毒的复制。因此，3B蛋白具有多种功能，在FMDV复制过程中发挥着重要作用。同时，基于FMDV3ABC非结构蛋白建立的ELISA方法已经被广泛用于FMDV感染的诊断。因此，围绕3B蛋白开展相关诊断及防控产品的开发具有重要的意义和良好的应用前景。近年来，反向遗传操作技术已经被广泛用于病毒毒力或病毒产量等生物特性的改造，而目前现有技术中还没有利用反向遗传操作技术靶向3B蛋白对FMDV的毒力或病毒的产量等生物学特性进行改造提升的方案。基于上述问题，本专利技术首先发现了3B蛋白具有免疫抑制功能，并通过突变PCR、基因合成等方法构建了一系列3B质粒突变体，筛选出了发挥免疫抑制功能的关键位点；其次通过在3B蛋白的三个重复拷贝中分别引入关键位点氨基酸突变，构建了3B蛋白免疫抑制位点消除的口蹄疫重组病毒，所述口蹄疫重组病毒在干扰素通路缺陷的口蹄疫生产细胞系BHK-21中能够稳定传代，并且病毒滴度不受影响，而其在猪源宿主细胞中毒力下降，发挥了更强的天然免疫应答诱导能力，可作为重组疫苗株；最后，将获得的重组疫苗株制备成灭活疫苗，能够促进早期免疫应答，诱导高水平抗体产生，提高了生物安全性，及免疫保护效力，具备良好的应用前景。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术提供一种构建口蹄疫重组病毒及由重组病毒制备口蹄疫重组疫苗株的策略，所述策略是通过以下技术方案实现的：本专利技术首先发现了FMDV3B蛋白具有较强的免疫抑制作用，可用于制备免疫抑制药物或试剂，基于此，本专利技术的目的在于提供一种口蹄疫病毒3B蛋白在制备免疫抑制剂中的应用。本专利技术的另一目的在于提供一种通过仅丧失口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能制备口蹄疫重组病毒的方法。由于口蹄疫病毒3B蛋白不仅具有免疫抑制功能，而且还能与5’非编码区N端结合，启动病毒3D蛋白(RNA聚合酶)对病毒RNA的合成、调节FMDV3A蛋白的功能，进而影响病毒的复制等。因此，本专利技术在不影响口蹄疫病毒3B蛋白其他功能的前提下，仅通过丧失口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能，就可以解除口蹄疫病毒3B蛋白抑制天然免疫应答的能力，降低口蹄疫病毒对宿主的致病力，可用于制备口蹄疫重组病毒。本专利技术的另一目的在于提供一种通过仅丧失口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能制备口蹄疫重组疫苗株的方法。由于口蹄疫病毒3B蛋白不仅具有免疫抑制功能，而且还能与5’非编码区N端结合，启动病毒3D蛋白(RNA聚合酶)对病毒RNA的合成、调节FMDV3A蛋白的功能，进而影响病毒的复制等。因此，本专利技术在不影响口蹄疫病毒3B蛋白其他功能的前提下，仅通过丧失口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能，就可以解除口蹄疫病毒3B蛋白抑制天然免疫应答的能力，降低FMDV对宿主的致病力，同时不影响口蹄疫病毒在干扰素通路缺陷的口蹄疫生产细胞系BHK-21中的生产性能，可用于制备口蹄疫重组疫苗株。优选地，所述使口蹄疫病毒3B蛋白免疫抑制功能丧失的方法包括基因缺失技术、基因突变技术、基因插入技术。本专利技术的目的在于：在不影响口蹄疫病毒3B蛋白其他功能的前提下，仅使口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能丧失。其中使口蹄疫病毒3B蛋白的构象、理化特性发生改变或与宿主蛋白结合力发生改变，可以使口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能丧失，而本领域常用的方法包括基因缺失技术、基因突变技术、基因插入技术等基因工程手段。根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使口蹄疫病毒3B蛋白的构象、理化特性或与宿主蛋白结合力发生改变，导致口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能丧失。优选地，所述使口蹄疫病毒3B蛋白免疫抑制功能丧失的方法为：将口蹄疫病毒3B蛋白中三个拷贝3B1、3B2和3B3的第17位氨基酸缺失或突变。优选地，所述使口蹄疫病毒3B蛋白免疫抑制功能丧失的方法为：将口蹄疫病毒3B蛋白中三个拷贝3B1、3B2和3B3的第17位氨基酸突变。优选地，所述使口蹄疫病毒3B蛋白免疫抑制功能丧失的方法为：将口蹄疫病毒3B蛋白中三个拷贝3B1、3B2和3B3氨基酸序列的第17位突变为极性氨基酸。...

【技术保护点】
1.口蹄疫病毒3B蛋白在制备免疫抑制剂中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.口蹄疫病毒3B蛋白在制备免疫抑制剂中的应用。


2.通过仅丧失口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能制备口蹄疫重组病毒的方法。


3.通过仅丧失口蹄疫病毒3B蛋白的免疫抑制功能制备口蹄疫重组疫苗株的方法。


4.一种口蹄疫重组病毒，其特征在于，将亲本口蹄疫病毒中3B蛋白的免疫抑制功能丧失。


5.一种包含权利要求4所述口蹄疫重组病毒的口蹄疫重组疫苗株。


6.一种制备口蹄疫重组病毒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)构建口蹄疫病毒全长感染性克隆。
(2)利用基因突变技术或基因合成...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑海学，杨帆，朱紫祥，张向乐，曹伟军，王聪聪，李康丽，刘会胜，田宏，张克山，刘湘涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62