定位壳聚糖硫酸酯的抗氧化活性的研究方法技术

本发明专利技术公开了一种定位壳聚糖硫酸酯的抗氧化活性的研究方法，研究了不同位点取代的壳聚糖硫酸酯（ＨＣＴＳ、ＴＳＣＴＳ、ＳＣＴＳ、ＴＣＴＳ）的抗氧化活性，发现这四种硫酸酯化衍生物具有明显得抑制超氧自由基、羟自由基作用、很强的还原能力；ＴＳＣＴＳ的抗有机自由基（ＤＰＰＨ）能力最强，其他位点磺化产物对ＤＰＰＨ作用不明显；ＴＳＣＴＳ及ＴＣＴＳ的螯合能力强于其他几种壳聚糖硫酸酯化衍生物；这四种衍生物也表现出很强的抑制Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］诱导的红细胞溶血的作用，其中ＨＣＴＳ及ＳＣＴＳ效果最佳，而ＴＳＣＴＳ剂量关系最显著；ＴＳＣＴＳ及ＴＣＴＳ具有明显的抑制肝匀浆脂质过氧化作用；总的抗氧化能力测定结果显示ＨＣＴＳ、ＳＣＴＳ、ＴＣＴＳ效果最佳，ＴＳＣＴＳ有一定的作用，但不明显。本发明专利技术可作为研制抗衰老药物的依据。（*该技术在2024年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及海洋药物的研究与开发，具体讲是一种，它可作为抗衰老药物的依据，其属于海洋生物

技术介绍
活性氧自由基对机体具有巨大的损伤作用，如会引起蛋白质损伤、酶失活、膜质过氧化，导致衰老、肿瘤、动脉粥样硬化等许多疾病的发生。因此筛选对人体安全、高效的活性氧清除剂有着重要的意义。对于人工合成的二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基甲氧基(BHA)、丙二醇(PG)等有较好的抗氧化活性，但长期食用对人体有伤害作用，因此在最近几年，海洋生物活性多糖的抗氧化作用受到广泛的重视。研究表明海洋生物活性多糖具有较高抗氧化能力。鼠尾藻多糖能有效的清除活性氧自由基。浒台多糖能提高超氧化物歧化酶(SOD)活力及降低肝、脾中脂褐质(LPO)的含量。壳聚糖是一种来源于甲壳类动物蟹虾的外壳及节肢类动物蟑螂等骨骼的天然碱性高分子多糖，对人体无毒副作用，可生物降解。但高分子量壳聚糖分子结构紧密，抗氧化作用不很明显，而其硫酸酯化衍生物由于具有与肝素类似的结构和强聚阴离子性质而引起了广大学者的关注，在抗凝、抗栓和抗病毒方面的研究均有较多报道。但壳聚糖硫酸酯的抗氧化活性方面研究不多，曾有文献报道壳聚糖硫酸酯衍生物对H2O2有明显的抗氧化活性，但对其他抗氧化方面如清除超氧阴离子自由基(O2·-)、羟自由基(·OH)、抑制有机自由基(DPPH)、红细胞溶血、肝匀浆脂质过氧化，壳聚糖硫酸酯对金属的螯合能力，他们的还原能力以及总的抗氧化能力均未见有报道。因此本专利技术拟就不同位点壳聚糖硫酸酯衍生物的抗氧化活性进行了探讨，并对各壳聚糖硫酸酯衍生物进行了抗氧化能力比较。
技术实现思路
本专利技术的目的是研究壳聚糖硫酸酯化衍生物的抗氧化能力，提供了一种，为今后能否成为抗衰老药提供依据。本专利技术是用以下实验方法对不同位点磺化的壳聚糖硫酸酯衍生物的抗氧化进行检测的。各不同位置壳聚糖磺化产物的缩写形式为C2，3，6位壳聚糖硫酸酯(HCTS)、C3，6位壳聚糖硫酸酯(TSCTS)、C3位壳聚糖硫酸酯(TCTS)、C6位壳聚糖硫酸酯(SCTS)。本专利技术的技术方案是一种，包括1)各磺化产物对超氧自由基的清除作用所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS对超氧自由基的清除能力均很强，由IC50可看出各样品清除超氧自由基的强弱顺序为HCTC＞SCTS＞TCTS＞TSCTS，而且各样品均具有浓度依赖性，即随着浓度增大清除超氧自由基的能力增强；2)各磺化产物对羟自由基的清除作用所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS对羟自由基的清除能力均很强，由IC50可看出各样品清除超氧自由基的强弱顺序为TCTS＞SCTC＞TSCTS＞HCTS，而且各样品均具有浓度依赖性，即随着浓度增大清除羟自由基的能力增强；3)各磺化产物对有机自由基的抑制作用所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS对有机自由基的抑制作用表现为TSCTS很强，其他磺化产物对有机自由基的清除不明显，均具有浓度依赖性，随着样品浓度增大清除有机自由基的能力增强；4)各磺化产物对H2O2诱导的红细胞氧化溶血实验所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS对抑制H2O2诱导的红细胞氧化溶血能力除TCTS外均很强，它们表现出一定的浓度依赖性，即随着浓度增大抑制H2O2诱导的红细胞氧化溶血能力增强；5)各磺化产物对大鼠肝匀浆脂质过氧化的作用所得结果为TSCTS、TCTS对抑制肝匀浆脂质过氧化作用明显，而HCTS、SCTS作用不明显，此四种壳聚糖硫酸酯衍生物对抑制脂质过氧化均表现出浓度依赖性；6)各磺化产物的还原能力测试所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS均具有很强的还原能力，还原能力强弱顺序为TSCTS＞TCTS＞SCTS＞HCTS；7)各磺化产物对金属离子螯合能力的测定所得结果为TSCTS、TCTS具有很强的螯合能力，而HCTS、SCTS作用不明显，此四种壳聚糖硫酸酯衍生物对金属螯合能力测试均表现出浓度依赖性；8)各磺化产物总的抗氧化能力实验，用β-胡萝卜素-亚油酸体系作为总抗氧化能力的评价所得结果为HCTS、SCTS、TCTS具有很强的抗氧化能力，随着时间的延长，达到2h且最大浓度为300mg/ml时，HCTS的抗氧化能力为67.60％，SCTS最大，达到90.23％，TCTS稍弱，为59.79％，它们均具有一定的浓度依赖性，而TSCTS随浓度变化总抗氧化能力变化不明显，用β-胡萝卜素-亚油酸体系衡量的TSCTS的总抗氧化能力比较弱。所述各磺化产物对超氧自由基的清除作用，采用吩嗪硫酸甲酯-NADH体系发生，反应体系为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液浓度为16mmo1/L，pH＝8.0，其中含有78μmo1/L还原型辅酶I，50μmo1/L硝基四氮唑蓝，10μmo1/L吩嗪硫酸甲酯，以及不同浓度的多糖溶液，超氧阴离子和硝基四氮唑蓝的显色反应采用分光光度法在560nm波长下测定反应液的吸光度，在空白对照实验中，用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液替换还原型辅酶I，实验结果以清除率E％标示清除率E％＝(A-A1)/(A-A0)×100％A空白对照值A1加入样品后的吸光值A0参比，值为0；所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS对超氧自由基的清除能力均很强，抗氧化性达50％时各样品的浓度IC50分别为0.012mg/ml，0.040mg/ml，0.015mg/ml，0.022mg/ml，由IC50可看出各样品清除超氧自由基的强弱顺序为HCTC＞SCTS＞TCTS＞TSCTS，而且各样品均具有浓度依赖性，即随着浓度增大清除超氧自由基的能力增强。所述各磺化产物对羟自由基的清除作用，·OH是由EDTANa2-Fe(II)-H2O2体系产生，由于·OH可特异地使藩红花红色褪色，根据褪色程度用比色法来衡量·OH的含量，按体积份数计，反应体系中包括0.2M、pH7.4的磷酸缓冲液1.5份，260μg/ml的藩红花红0.2份，体积百分比浓度为3％的H2O20.8份，EDTANa2-Fe(II)0.7份，0.8份不同浓度的壳聚糖溶液，混合均匀后于37℃水浴保温30min，然后于520nm处测吸光度A值，空白组以重蒸馏水代替供试液，对照组以重蒸馏水代替供试液和EDTANa2-Fe(II)，反应总体积为4.0份，实验结果以清除率F％表示清除率F％＝(A样品-A空白)/(A对照-A空白)×100％所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS对羟自由基的清除能力均很强，IC50分别为1.369mg/ml，1.184mg/ml，0.925mg/ml，0.350mg/ml，由IC50可看出各样品清除超氧自由基的强弱顺序为TCTS＞SCTC＞TSCTS＞HCTS，而且各样品均具有浓度依赖性，即随着浓度增大清除羟自由基的能力增强。所述各磺化产物对有机自由基的抑制作用，将样品溶于50％甲醇-水或50％乙醇-水的混合溶液中配成不同浓度的供试液，按体积份数计，将1份上述供试液与1.5份用95％甲醇或乙醇溶解的0.1mM 1，1-二苯基苦基苯肼溶液混合，振荡均匀，在室温放置20min后，于517nm处测定其吸光度值，阴性对照为DPPH有机自由基醇溶液，DPPH有机自由基现用现配；清除率G％＝(1-A样品/A对照)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定位壳聚糖硫酸酯的抗氧化活性的研究方法，其特征在于包括：１）各磺化产物对超氧自由基的清除作用所得结果为ＨＣＴＳ、ＴＳＣＴＳ、ＳＣＴＳ、ＴＣＴＳ对超氧自由基的清除能力均很强，由ＩＣ↓［５０］可看出各样品清除超氧自由基的强弱 顺序为ＨＣＴＣ＞ＳＣＴＳ＞ＴＣＴＳ＞ＴＳＣＴＳ，而且各样品均具有浓度依赖性，即随着浓度增大清除超氧自由基的能力增强；２）各磺化产物对羟自由基的清除作用所得结果为ＨＣＴＳ、ＴＳＣＴＳ、ＳＣＴＳ、ＴＣＴＳ对羟自由基的清除能力均很 强，由ＩＣ↓［５０］可看出各样品清除超氧自由基的强弱顺序为ＴＣＴＳ＞ＳＣＴＣ＞ＴＳＣＴＳ＞ＨＣＴＳ，而且各样品均具有浓度依赖性，即随着浓度增大清除羟自由基的能力增强；３）各磺化产物对有机自由基的抑制作用所得结果为ＨＣＴＳ、Ｔ ＳＣＴＳ、ＳＣＴＳ、ＴＣＴＳ对有机自由基的抑制作用表现为ＴＳＣＴＳ很强，其他磺化产物对有机自由基的清除不明显，均具有浓度依赖性，随着样品浓度增大清除有机自由基的能力增强；４）各磺化产物对Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］诱导的红细胞氧化溶血实验　 　所得结果为ＨＣＴＳ、ＴＳＣＴＳ、ＳＣＴＳ、ＴＣＴＳ对抑制Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］诱导的红细胞氧化溶血能力除ＴＣＴＳ外均很强，它们表现出一定的浓度依赖性，即随着浓度增大抑制Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］诱导的红细胞氧化溶血能力增强；５）各磺化 产物对大鼠肝匀浆脂质过氧化的作用所得结果为ＴＳＣＴＳ、ＴＣＴＳ对抑制肝匀浆脂质过氧化作用明显，而ＨＣＴＳ、ＳＣＴＳ作用不明显，此四种壳聚糖硫酸酯衍生物对抑制脂质过氧化均表现出浓度依赖性；６）各磺化产物的还原能力测试： 所得结果为ＨＣＴＳ、ＴＳＣＴＳ、ＳＣＴＳ、ＴＣＴＳ均具有很强的还原能力，还原能力强弱顺序为ＴＳＣＴＳ＞ＴＣＴＳ＞ＳＣＴＳ＞ＨＣＴＳ；７）各磺化产物对金属离子螯合能力的测定：所得结果为ＴＳＣＴＳ、ＴＣＴＳ具有很强的螯合能力，而 ＨＣＴＳ、ＳＣＴＳ作用不明显，此四种壳聚糖硫酸酯衍生物对金属螯合能力测试均表现出浓度依赖性；８）各磺化产物总的抗氧化能力实验，用β－胡萝卜素－亚油酸体系作为总抗氧化能力的评价；所得结果为ＨＣＴＳ、ＳＣＴＳ、ＴＣＴＳ具有很强的 抗氧化能力，随着时间的延长，达到２ｈ且最大浓度为３００ｍｇ／ｍｌ时，ＨＣＴＳ的抗氧化能力为６７．６０％，ＳＣＴＳ最大，达到９０...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李鹏程，邢荣娥，刘松，于华华，郭占勇，王丕波，李翠萍，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：21[中国|辽宁]