葡萄糖异构酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术披露利用基因突变技术改良的一系列具有耐热高催化活性性能、适合于测定果糖含量的Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ葡萄糖异构酶。以序列表中的序列２为参考序列，这些葡萄糖异构酶突变体具有在第１８６位的突变和选自第１３９位、第１８２位、第１８７位和第２９９位的至少三个突变，可以果糖为底物生成葡萄糖，进而用于测定人体内、或体内某一器官、或其它生物体、或商品中果糖的含量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学与生物
，具体地说，涉及高活力、或高活力并耐热的葡萄糖异构酶突变体、在测定果糖方面的应用和所使用的试剂盒。
技术介绍
精液中的果糖由精囊腺分泌，是供精子代谢活动的重要营养成分。因此，果糖含量高低直接影响精子的活力。临床上精液果糖测定主要用于精囊、输精管、前列腺疾病的诊断和鉴别诊断以及不孕症的诊断。近年来发现，精囊分泌果糖的功能受雄激素的调控，故精液的果糖含量可反映体内雄激素水平的变化，精液果糖测定可用于男性性腺分泌功能及性功能的评价及相关疾病的诊断。尽管精液果糖测定在临床上具有多方面的重要价值，但由于检测方法的限制，临床实验室并未广泛开展精液果糖分析。目前测定精液果糖的方法主要有色谱法、化学法及果糖脱氢酶法。色谱法受仪器的限制，因临床实验室很少拥有高效液相色谱仪，也缺乏有关技术。化学法利用果糖和间苯二酚、吲哚或咔唑等化合物反应生成颜色变化，通过比色求得含量，但这些化学显色反应都必须在强酸性介质和高温(80-100oC)中进行，操作中需加入高浓度的硫酸或盐酸，不安全，也不适合自动生化分析仪操作；而且显色产物不稳定，重复性很差，误差可高达100％。脱氢酶法是90年代发展的新方法，反应条件温和，结果准确，但果糖脱氢酶及其显色剂的化学性质不稳定，两者都需使用前新鲜配制，且酶试剂价格昂贵，因此其商业化应用也受到限制。因此可以说，到目前为止临床上还没有一种真正理想而实用的精液果糖测定方法。葡萄糖异构酶(Glucose isomerase，E.C.5.3.1.5，简称GI)催化葡萄糖产生果糖，也可以果糖为底物生成葡萄糖。现有的葡萄糖异构酶催化果糖产生葡萄糖的活力低，测定精液果糖的灵敏度相应也低，不敷临床检验精液果糖之用。因此，目前需要首先提供一系列耐高温、能高效率地将果糖转化为葡萄糖的葡萄糖异构酶，然后利用葡萄糖异构酶来高效、灵敏地检测果糖含量。
技术实现思路
本专利技术利用遗传工程和蛋白质工程技术对来源于Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum的葡萄糖异构酶进行改良，培育出了一系列耐高温、高效率将果糖转化为葡萄糖的葡萄糖异构酶。这些葡萄糖异构酶将精液中的果糖有效转化成葡萄糖，然后用葡萄糖氧化酶法测定生成的葡萄糖的数量，进而可以确定精液中果糖的含量。本专利技术的方法是项世界首创的新检测方法，克服了现有测定精液果糖方法的弊端，具有操作简便、结果准确、反应条件温和、成本低廉、试剂稳定以及便于商业操作等特点。本专利技术的葡萄糖异构酶突变体还可以用于人体内、或体内某一器官、或其它生物体、或商品中果糖含量的测定。本专利技术的目的在于提供具有高效催化果糖为葡萄糖之活性、或具高效催化果糖为葡萄糖之活性并耐热的葡萄糖异构酶突变体。本专利技术还相应地提供了编码所述葡萄糖异构酶突变体的DNA和这些突变体用于测定果糖含量的应用。具体而言，本专利技术包括如下方面一方面，本专利技术提供了一种葡萄糖异构酶突变体，其特征在于以序列表中的序列2(SEQ ID NO.2)为参考序列，具有在第186位的突变和选自第139位、第182位、第187位和第299位的至少三个突变，所述第139位的色氨酸突变为赖氨酸(Lys)、或丝氨酸(Ser)、或半胱氨酸(Cys)、或异亮氨酸(Ile)、或苏氨酸(Thr)、或天冬酰胺(Asn)、或苯丙氨酸(Phe)，所述第182位的精氨酸突变为脯氨酸(Pro)、或丝氨酸(Ser)、或丙氨酸(Ala)、或异亮氨酸(Ile)、或苏氨酸(Thr)、或缬氨酸(Val)，所述第186位的缬氨酸突变为苏氨酸(Thr)、或丙氨酸(Ala)、或天门冬氨酸(Asp)，所述第187位的苯丙氨酸突变为甘氨酸(Gly)、或丝氨酸(Ser)、或丙氨酸(Ala)、或脯氨酸(Pro)，以及所述第299位的苏氨酸突变为异亮氨酸(Ile)、或酪氨酸(Tyr)、或半胱氨酸(Cys)、或蛋氨酸(Met)、或谷氨酸(Glu)、或谷氨酰胺(Gln)。优选的是，本专利技术的葡萄糖异构酶突变体具有序列4(SEQ ID NO.4)所列的氨基酸序列，其中第139位的X代表苯丙氨酸(Phe)、第182位的X代表丙氨酸(Ala)、第186位的X代表苏氨酸(Thr)，第187位的X代表苯丙氨酸，同时第299位的X代表谷氨酰胺(Gln)。另一方面，本专利技术提供了含有编码本专利技术所述的葡萄糖异构酶突变体的核苷酸序列的DNA。再一方面，提供了将本专利技术葡萄糖异构酶突变体应用于测定果糖含量。使用本专利技术所述的高催化活性的葡萄糖异构酶突变体可以测定人体体液、或体内某一器官的果糖含量。在测定人体精液的果糖含量时，本专利技术的葡萄糖异构酶突变体特别有用。又一方面，本专利技术提供一种测定人精液中果糖含量的方法，包括如下步骤1)获取人精液样品；2)将本专利技术所述的葡萄糖异构酶突变体加入到精液样品中，获得反应混合物；3)将反应混合物在65-80℃反应20-40分钟，优选在75℃下反应30分钟；和4)测得反应结束后的反应混合物中的果糖含量。在进行步骤2)之前，还优选包括除去精液样品中的蛋白的步骤。该步骤的实施有许多方式，例如，可以通过将精液样品与离子交换树脂接触、或者通过向精液样品中加入蛋白变性剂使精液样品中的蛋白变性后再分离、或者通过将精液样品在90-100℃加热20-40分钟后再离心而实现。现有技术中有许多离子交换树脂可以使用，例如，Chelex 100。对于蛋白变性剂，也没有特别的限制。但是，出于对后续步骤的影响程度的角度考虑，优选使用那些易于从反应体系中除去的蛋白变性剂。还一方面，本专利技术提供一种用于测定人精液中果糖含量的试剂盒，其特征在于包含本专利技术的葡萄糖异构酶突变体。优选的试剂盒还包括用于除去待测精液样品中的蛋白的试剂和葡萄糖氧化酶。在本专利技术的试剂盒中，其中所述用于除去待测精液样品中的蛋白的试剂可以是离子交换树脂，也可以是一般的蛋白变性剂。从易于处理和对后续步骤的影响程度的角度来看，使用离子交换树脂是较为优选的。为了提高测定的准确度，本专利技术试剂盒还可包括果糖浓度标准溶液。当然，标准溶液的功能也可以用计算机来实现。附图表说明下列附图用于说明本专利技术的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本专利技术范围。附图说明图1葡萄糖异构酶突变体MGI-4B聚丙烯酰胺凝胶电泳图。其中从左至右的四条泳道依次为蛋白分子量标准、牛血清白蛋白、粗提蛋白、部分纯化的葡萄糖异构酶突变体MGI-4B。(粗提蛋白、部分纯化的葡萄糖异构酶突变体MGI-4B的制备见实例9)图2亲本葡萄糖异构酶与葡萄糖异构酶突变体在80℃的热稳定。其中MGI-4B代表具有四个突变位点的葡萄糖异构酶突变体，具体请参见实例13。图3显示的是果糖含量测定标准曲线。具体实施例方式本专利技术对Thermoanaerobacterium saccharolyticum葡萄糖异构酶基因进行定点突变，随后在MacConkey(DIFCO，USA)培养基上筛选葡萄糖异构酶克隆，从而取得一系列具有高效催化果糖为葡萄糖活性、或具高效催化果糖为葡萄糖活性并耐热的葡萄糖异构酶突变体。如其中的一个突变体MGI-4B的比活性较亲本高755％。本专利技术中亲本基因系指来自Thermoanaerobacterium sachcharolyticum ATCC 4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葡萄糖异构酶突变体，其特征在于以序列表中的ＳＥＱＩＤＮＯ．：２为参考序列，具有在第１８６位的突变和选自第１３９位、第１８２位、第１８７位和第２９９位的至少三个突变，所述第１３９位的色氨酸突变为赖氨酸（Ｌｙｓ）、或丝氨酸（Ｓｅｒ） 、或半胱氨酸（Ｃｙｓ）、或异亮氨酸（Ｉｌｅ）、或苏氨酸（Ｔｈｒ）、或天冬酰胺（Ａｓｎ）、或苯丙氨酸（Ｐｈｅ），所述第１８２位的精氨酸突变为脯氨酸（Ｐｒｏ）、或丝氨酸（Ｓｅｒ）、或丙氨酸（Ａｌａ）、或异亮氨酸（Ｉｌｅ）、或苏氨酸（Ｔｈｒ）、或缬氨酸（Ｖａｌ），所述第１８６位的缬氨酸突变为苏氨酸（Ｔｈｒ）、或丙氨酸（Ａｌａ）、或天门冬氨酸（Ａｓｐ），所述第１８７位的苯丙氨酸突变为甘氨酸（Ｇｌｙ）、或丝氨酸（Ｓｅｒ）、或丙氨酸（Ａｌａ）、或脯氨酸（Ｐｒｏ），以及所述第２９９位的苏氨酸突变为异亮氨酸（Ｉｌｅ）、或酪氨酸（Ｔｙｒ）、或半胱氨酸（Ｃｙｓ）、或蛋氨酸（Ｍｅｔ）、或谷氨酸（Ｇｌｕ）、或谷氨酰胺（Ｇｌｎ）。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王骏，傅荣昭，金彩科，沈冬，
申请(专利权)人：百瑞全球有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]