酶法测定钾离子含量的方法及钾离子诊断试剂盒技术

本发明专利技术涉及酶法测定钾离子含量的方法及钾离子诊断试剂盒。利用钾离子激化丙酮酸激酶的特性，使腺苷二磷酸与磷酸烯醇式丙酮酸反应生成腺苷三磷酸，再偶联己糖激酶、葡萄糖磷酸脱氢酶发生反应，将氧化型辅酶还原成还原型辅酶，通过测定主波长３４０ｎｍ处吸光度的上升速度定量反映出样品中钾离子的含量。该方法特异性高，不受样品中钠离子的影响，也不受内、外源物质的污染，测试结果精确、准确性好。将诊断试剂盒制成双剂或三剂可减少各成分的交叉影响，保持试剂的稳定性，便于长期储存。该方法在普通紫外／可见光分析仪或者半自动／全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及酶法测定血清、血浆等样品中钾离子含量的方法，以及应用该方法配制而成的钾离子诊断试剂盒，属于医学检验测定

技术介绍
血清中钾离子含量(简称“血钾”)在临床上有着非常重要的意义，正常情况下人体内血钾有合理的参考值范围。当血钾低于参考值下限时，表现出低钾血症，其原因有肾小管疾病、高醛固酮症、胰岛素过多症、代谢性碱中毒，或者是使用胰岛素治疗糖尿病酮症、使用利尿剂治疗某些疾病过程中钾离子转移到细胞内部等；血钾高于参考值上限时，可能是由于肾小球疾病、肾功能衰弱、糖尿病酮症中毒、肾上腺皮质功能减退等引起；当血钾达到或超过7.5mmol/l时，病人将出现心律失常，应考虑确定适当的治疗方案；血钾超过10mmol/l，即可发生心室纤颤、心脏停搏而死亡。高钾使心脏停跳于舒张期。现有技术中测定钾离子含量的常用方法有同位素稀释质谱法、中子活化法、火焰光度计法、化学测定法、离子选择电极法、原子分光光度法、酶动力学法等。其中，决定性方法是同位素稀释质谱法及中子活化法，其次是火焰光度计法、离子选择电极法。火焰光度计法——1950年开始使用并一直沿用至今，可检测血清、尿液、脑脊液及胸腹水中的Na+和K+，是一种发射光谱分析法，测定方法分为内标准法和外标准法两种。外标准法操作误差较大，一般不采用。现在主要使用内部标准法，即向标本及标准液中加进相同浓度的内部标准元素锂或铯进行测定，操作时，将含锂的溶液作为稀释液，同时测定K+、Na+和Li+的浓度，以标本与标准液的Na+/Li+与K+/Li+比值，计算Na+、K+浓度。由于血清稀释倍数大，血清蛋白质粘性的影响几乎可以忽略不计。离子选择电极法——简称ISE法，是采用灵敏的特定专用电极，在专用仪器上进行血清和尿等体液中的K+、Na+的测定，因标本用量少，快速准确，几乎有取代其它方法的趋势。其测定原理是，用离子选择电极与参比电极组合起来，浸泡在待测标本溶液中进行检测。目前已有的电极种类有□玻璃膜电极，感应材料为玻璃薄膜，有PH电极、K+电极和Na+电极；□固相膜电极，由难溶性金属物质加压成型，以固体膜或单日膜作为感应膜，有Cl-电极和F-电极；□液态膜电极，将环氧树脂或内装聚氯乙稀作为感应膜，有Ca2+电极；□用缬氨霉素膜制成的K+电极。上述电极均有一定的使用寿命，因为电极使用一段时间后就会自动老化，有效期长短不一。目前离子选择电极法应用较为普遍，但是电极成本昂贵。此外，化学测定法主要利用复环王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，作为离子载体进行测定。由于大环结构内有空穴，分子内部的氧原子有未共用电子对可与金属离子结合，根据空穴大小，可选择性结合不同直径的金属离子，从而达到测出离子浓度的目的(测定血钾，一般采用普通冠醚阴离子染料进行比色定量)；原子分光光度法也可用于检测血清中K+、Na+，但操作繁杂，误差较大，不及火焰光度法简便。酶法测定钾离子含量的方法，与火焰光度计法或离子选择电极法都有较好的一致性，这种方法抗干扰性强、稳定性好，但用生化分析仪不能同时测定钾离子和钠离子各自的含量，导致这种方法不能得到推广应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可以克服现有技术缺陷的酶法测定钾离子含量的方法，以及应用该方法配制而成的钾离子诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂，能够利用紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪测定出血清、血浆等样品中钾离子含量，测定过程不受钠离子的影响，测定速度快、准确度高，为临床及化学分析中推广酶法检测钾离子含量提供技术支撑。为实现本专利技术的目的之一，一种酶法测定钾离子含量的方法，采用以下步骤进行首先，将需要测定的样品与含有腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、葡萄糖、丙酮酸激酶、己糖激酶、葡萄糖磷酸脱氢酶和氧化型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应， (其中“6-磷酸葡糖酸内酯”即6-phospho-D-gluconolactone)然后，将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长340nm的吸光度的上升速度，进而测算出样品中钾离子的含量。测定过程中，被测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10～1∶500，反应温度控制在20℃～50℃，反应时间控制在2～30分钟，检测时设定副波长在405nm以上。实现本专利技术另外一个目的——钾离子诊断试剂盒，可以是由以下成分组成的单剂缓冲液 40～200mmol/l，腺苷二磷酸 1～10mmol/l，磷酸烯醇式丙酮酸 1～5mmol/l，葡萄糖 1～40mmol/l，氧化型辅酶 0.2～5mmol/l， 丙酮酸激酶 4000～20000U/l，己糖激酶4000～50000U/l，葡萄糖磷酸脱氢酶4000～50000U/l，稳定剂/试剂总体积 10～80％。也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，以利于消除内、外源物质污染，比如 双剂配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I的成分——腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、葡萄糖、氧化型辅酶、己糖激酶、葡萄糖磷酸脱氢酶等，可以放在试剂II；试剂II中的丙酮酸激酶也可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。还可以将试剂配成如下三试剂，不但更有利于消除内、外源物质污染，还有利于试剂更稳定 与双剂类似，三剂配方也不仅仅限于上述配方，其中试剂I中腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、葡萄糖和氧化型辅酶可以放在试剂II或试剂III中，试剂II中的己糖激酶和葡萄糖磷酸脱氢酶可以放在试剂I或试剂III中，试剂III中的丙酮酸激酶也可以放到试剂I或者试剂II中，如此可以形成多种配方，不再一一列举。以上配制钾离子诊断试剂盒时，选择缓冲液的基本要求是PH值在6.0～11.0范围之内，可以是“三羟甲基氨基甲烷～盐酸(Tris-HCl)缓冲液”、“三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液”、“咪唑～盐酸(Imidazole-HCl)缓冲液”、“双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液”、“柠檬酸～柠檬酸钠缓冲液”、“巴比妥钠～盐酸缓冲液”、“碳酸钠～碳酸氢钠缓冲液”、“硼酸～硼砂缓冲液”、“甘氨酸～氢氧化钠缓冲液”、“硼砂～氢氧化钠缓冲液”、“磷酸钠(Sodium Phosphate)缓冲液”或者“磷酸盐(Phosphate-Sodium Chloride，PBS)缓冲液”中的至少一种，但缓冲液的选择范围并不受这些列举所限制。此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II、三剂的试剂I/试剂II/试剂III当中通常加入稳定剂，其用量约占所在试剂总体积的10～80％(或者浓度在10～50mmol/l范围之内)。用作稳定剂的物质可以是乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸盐或者氯化钠中的至少一种，但选择范围同样不受这些列举所限制。上述诊断试剂盒的成分当中，所述氧化型辅酶是——氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶法测定钾离子含量的方法，包括以下步骤：①将待测样品与含有腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、葡萄糖、丙酮酸激酶、己糖激酶、葡萄糖磷酸脱氢酶和氧化型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应，腺苷二磷酸＋磷酸烯醇式丙酮酸＊腺苷三磷酸＋丙 酮酸葡萄糖＋腺苷三磷酸＊葡萄糖－６－磷酸＋腺苷二磷酸葡萄糖－６－磷酸＋氧化型辅酶＊还原型辅酶＋６－磷酸葡萄酸内酯②将反应混合物置于紫外／可见光分析仪或者半自动／全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ的吸光度的上升速 度，测算出样品中钾离子的含量。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]