碳纳米管的生物学应用制造技术

本发明专利技术提供了一种碳纳米管提高基因扩增产率和基因转化（转染）率的新方法，包括：（１）将新型纳米材料－碳纳米管引入基因扩增系统，如ＤＮＡ聚合酶链式基因扩增反应系统，能够有效促进基因扩增，提高基因扩增产率；（２）在基因导入原核细胞的过程中，加入碳纳米管，能够将原核细胞的基因转化效率提高７倍；（３）在基因导入真核细胞中，使用碳纳米管能够将携带外源基因的载体导入真核细胞，从而为真核细胞转染提供了一种新的方法。本发明专利技术不仅为基因扩增和基因导入细胞提供了一种高效、简便、经济的新方法，而且为基因诊断和基因治疗提供了一条新途径。（*该技术在2024年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及纳米材料学与分子生物学和基因治疗的交叉学科。更具体地，本专利技术涉及碳纳米管在分子生物学和基因治疗等中的应用。
技术介绍
在分子生物学和基因治疗的有关技术中，如在基因扩增和基因的转化或转染中，实验产率或效率的提高可以极大地推动相关研究的进展。体外基因扩增法又称聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)，是80年代中期开创的一种新技术，它能在一个反应试管中将所要研究的目的基因或DNA片段在短短数小时内扩增上百万倍，可以直接用于基因的分离和分析，是分子生物学中一项革命性技术。其原理是利用两种寡核苷酸引物分别与特异性DNA区段的正链和负链末端互补，经过模板DNA变性，模板DNA-引物配对，在DNA聚合酶作用下发生引物链的延伸发应，三个反应阶段导致新互补链的合成。引物链的延伸产物与原来模板DNA经加热变性后，作为模板DNA和另一种引物互补，在DNA聚合酶作用下又发生引物链的延伸反应，如此反复循环数十次，可使特异性DNA区段以几何级数倍增。反应体系包括(参见J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔，《分子克隆实验指南》第二版672页)被检测的DNA片段，即模板；两条分别与被检测的DNA片段正链和负链末端互补的寡核苷酸引物链(一般为20个核苷酸左右)；四种dNTP；DNA聚合酶；MgCl2，反应缓冲液和水。基因扩增技术在疾病诊断和法医鉴定方面起着重要作用。例如，在一些感染性疾病中，确定致病病原体(如HIV病毒和SARS病毒)；在肿瘤患者体内，检测某些癌基因的存在；在法医DNA指纹个体识别和亲子关系鉴定等等都涉及基因扩增技术。另外，基因扩增技术在考古研究领域应用极为广泛。因此，提高基因扩增效率是增加基因诊断灵敏度和提高基因治疗成功率的关键，也是研究人员一直探索的一个重要课题。而基因的转化或转染是指把外源基因导入宿主细胞并使其在宿主细胞中发挥作用，将外源基因导入原核细胞称为转化，将外源基因导入真核细胞称为转染，这是生命科学研究领域中一种常用的重要技术和方法，也是基因治疗的首要和关键技术(附图1)。因此，开发新的细胞转染方法和提高基因的转化效率一直是生命科学研究和基因治疗临床研究的重要课题。目前用于原核细胞基因转染的常用技术是氯化钙法和电穿孔法，转化率最高可达109。用于真核细胞基因转染的方法包括磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖转染法、聚阳离子-DMSO转染法、脂质体转染法、电穿孔法、显微注射法、原生质体融合法、病毒介导的转染法。这些方法都是通过物理和化学成分影响细胞膜，改变细胞膜的通透性，使外源基因进入细胞，但转化效率不高。表1将各种转染方法的主要特点进行了比较。表1.几种常用转染方法的主要特点的比较 真核细胞转染方法在基因表达、基因治疗和DNA疫苗的应用中都具有重要意义，在开发新的转染方法时，不仅要考虑转染的效率的高低，还要考虑转染材料对细胞乃至活体的毒性大小，所以尽管目前开发的真核细胞转染方法已经有很多，但都具有缺陷，不能满足现在实验和临床的需要。比如目前常用的脂质体Lipofectamine 2000转染试剂，虽然具有较高的转染效率，但对细胞毒性比较大，因此仅比较适合体外细胞转染。新的转染方法的开发和建立有助于这些问题的解决。
技术实现思路
针对上述研究背景，本专利技术人通过深入研究，突破了化学和分子生物学的局限性，从一个新的视角把新型碳纳米管(carbon nanotube，CNT)材料引入分子生物学技术，有效地提高了基因扩增的产率和基因转化或转染的效率。因此，本专利技术的一个目的是提供碳纳米管在提高PCR基因扩增产率中的应用，其中在PCR反应体系中加入碳纳米管。优选所述碳纳米管是羧基或羟基修饰的碳纳米管。本专利技术另一个目的是提供碳纳米管在提高原核细胞的基因转化效率中的应用，其中在基因转化体系中加入碳纳米管。优选所述碳纳米管是羧基或羟基修饰的碳纳米管。本专利技术还有一个目的是提供碳纳米管在提高真核细胞的基因转染效率中的应用，其中在碳纳米管的存在下将携带外源基因的载体导入真核细胞。优选所述碳纳米管是氨基修饰的碳纳米管。本专利技术的上述应用可以是用于法医鉴定、疾病诊断、基因治疗和细胞治疗领域。本专利技术与传统的PCR反应相比，其特点在于PCR反应中引入了碳纳米管材料。这种策略是基于两点理论基础(1)碳纳米管与DNA相互作用。碳纳米管表层是碳原子组成的六元环或五元环，能够与DNA形成π-π键，同时碳纳米管表面的羧基能够与DNA形成氢键(Nature Materials，2003，2，338-342)；(2)碳纳米管与PCR反应中的酶相互作用(Nanotechnology15154，2004)。碳纳米管可与蛋白酶的疏水界面通过疏水作用与之结合，亦可借助羧基或羟基与蛋白酶形成氢键。这一新技术的专利技术不仅推动纳米生物学的发展，而且为控制疾病的传播途径、明确癌症的诊断和治疗、指导临床用药提供了新方法和新途径。本专利技术的特色在于利用碳纳米管与DNA相互作用以及碳纳米管与细胞膜相互作用的特点，建立了以碳纳米管为介质的新的转染方法，并把这种方法应用于原核和真核两个基因转化系统，通过碳纳米管的作用促进基因的转化或转染，从而有效提高基因转化率。本专利技术应用于原核细胞的基因转化，能够使基因转化效率提高10倍。本专利技术应用碳纳米管成功地实现了真核细胞的基因转染，建立了一种新型的真核细胞基因转染方法。本专利技术适用于任何一种基因在不同细胞中的转化。本专利技术与传统基因转化或转染方法相比，使原核基因转化率明显提高，而且碳纳米管应用于真核细胞转染是一种新型的转染方法，这不仅丰富了分子生物学技术，而且在基因治疗中具有重要的应用价值。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步的详细描述，但不应理解为是对本专利技术进行限定。图1.基因转化或转染在生物和医学中的应用；图2.羧基修饰的多壁碳纳米管对PCR扩增产率的影响，A.琼脂糖凝胶电泳分析各组PCR扩增产物；B.分析各组PCR产物中的DNA含量。图中的0、1、2、3、4、5、6、7分别代表不同的组，与表2中的组相对应； 图3.羟基修饰的多壁碳纳米管对PCR扩增产率的影响，A.琼脂糖凝胶电泳分析各组PCR扩增产物；B.分析各组PCR产物中的DNA含量。图中的0、1、2、3、4、5、6分别代表不同的组，与表3中的组相对应；图4.羧基修饰碳纳米管促进原核细胞BL21基因转化，A.碳纳米管促进转化的实验对比图；B.转化菌落数计数的对比分析；图5.羟基修饰的碳纳米管促进原核细胞TOP10基因转化，菌落计数对比分析；图6.氨基修饰的多壁碳纳米管介导的细胞转染荧光观察(细胞放大倍数200)，左对照组；右实验组。具体实施例方式下面结合附图对理解本专利技术作进一步的详细描述，但并非对本专利技术作限定。实施例1碳纳米管提高基因扩增产率本专利技术所采取的研究策略是在PCR基因扩增反应体系中加入适量的碳纳米管，提高基因的扩增效率，电泳分析鉴定基因扩增产率。一、羧基修饰的多壁碳纳米管提高基因扩增产率在本实验中使用的扩增模板是T载体(PROMEGA公司，商品号A1360)上鼠抗体重链可变区(吴小平等，抗肿瘤血管三结构域单链抗体VH/L的构建与表达，生物工程学报17(1)50-54，2001)，引物长为26个本文档来自技高网...

【技术保护点】
碳纳米管在提高ＰＣＲ基因扩增产率中的应用，其中在ＰＣＲ反应体系中加入碳纳米管。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：阎锡蕴，高利增，王太宏，聂棱，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]